本文選題：H7N9禽流感病毒 + MS2噬菌體病毒樣顆粒　； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2015年博士論文

【摘要】：H7N9禽流感病毒是一種新亞型流感病毒,于2013年3月在我國上海和安徽兩地率先發(fā)現(xiàn)。H7N9禽流感病毒感染后的死亡率較高,因此對(duì)該病毒早期準(zhǔn)確的診斷成為挽救患者生命的關(guān)鍵。作為一種RNA病毒,H7N9禽流感病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)包括病毒核酸提取、逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增等多個(gè)步驟,每一步操作不當(dāng)均會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果,誤導(dǎo)臨床診斷,延誤患者的治療。為了提高全國醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室和流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室H7N9禽流感病毒的檢測(cè)能力,2013年7月衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心組織了一次室間質(zhì)量評(píng)價(jià)。我們制備了基于MS2噬菌體病毒樣顆粒(Bacteriophage MS2 virus-like particles, MS2 VLPs)的內(nèi)含H7N9禽流感病毒血凝素(Hemagglutinin, HA)、神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase, NA)、基質(zhì)蛋白(Matrix protein, MP)和核蛋白(Nucleoprotein, NP)四種蛋白全長(zhǎng)RNA序列的質(zhì)控品,向全國參與H7N9病毒檢測(cè)的醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室和流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室發(fā)放,以評(píng)價(jià)參評(píng)實(shí)驗(yàn)室H7N9禽流感病毒的檢測(cè)能力,指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室提高檢測(cè)水平。所發(fā)放的樣本盤含有10個(gè)樣本,其中包括6個(gè)含不同濃度H7N9禽流感病毒基因的陽性樣本和4個(gè)H7N9陰性樣本(包括1個(gè)MP基因陽性的樣本)。樣本盤發(fā)放到全國79家進(jìn)行H7N9禽流感病毒分子檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室,并根據(jù)實(shí)驗(yàn)室H7和N9兩個(gè)基因的檢測(cè)情況對(duì)結(jié)果進(jìn)行了分析。我們共收到80份回報(bào)結(jié)果(其中一家實(shí)驗(yàn)室回報(bào)了2份結(jié)果),其中77份結(jié)果采用real-time RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)：60份采用商品化試劑盒檢測(cè),17份采用實(shí)驗(yàn)室自配試劑檢測(cè)；還有3份結(jié)果采用等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示82.5%的實(shí)驗(yàn)室能夠正確檢測(cè)不同濃度的H7N9禽流感病毒樣本及陰性樣本。但是仍有17.5%的實(shí)驗(yàn)室需要改進(jìn)檢測(cè)能力,有待改進(jìn)的實(shí)驗(yàn)室中大部分漏檢了相對(duì)較低濃度的N9基因�？傮w檢測(cè)的假陰性率為5.6%,假陽性率為0.6%,選用不同的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法得出的結(jié)果不盡相同。本次室間質(zhì)量評(píng)價(jià)的結(jié)果表明我國大多數(shù)核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室具備了H7N9禽流感病毒核酸檢測(cè)的能力。MS2 VLPs不僅能夠包裝外源mRNA,還可以用于miRNAs前體的包裝,用來作為niRNAs的遞送載體。在第二部分中,我們通過對(duì)MS2 VLPs表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行改造,制備了表面展示細(xì)胞穿透肽HIV-1 TAT且內(nèi)含miR-122前體的重組MS2VLPs-TAT-MS2-miR122 VLPs,進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TAT-MS2-miR122 VLPs能夠攜帶miR-122前體進(jìn)入Hep3B肝癌細(xì)胞系,在細(xì)胞內(nèi)加工成成熟的miR-122,使Hep3B細(xì)胞內(nèi)miR-122表達(dá)水平升高,高表達(dá)的miR-122通過對(duì)腫瘤相關(guān)靶蛋白的調(diào)節(jié)發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。這一部分中我們將兩條重復(fù)的MS2噬菌體衣殼蛋白編碼序列串聯(lián)組成單鏈二聚體,并在單鏈二聚體序列的N端插入帶有連接臂的穿透肽HIV-1 TAT的cDNA序列,隨后把這一嵌合序列構(gòu)建到真核表達(dá)質(zhì)粒pESC-URA的Gal 10啟動(dòng)子下游；將與包裝位點(diǎn)序列串聯(lián)的pre-miR-122序列構(gòu)建到Gal 1啟動(dòng)子的下游,構(gòu)建完成的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到釀酒酵母細(xì)胞中,搖菌表達(dá)得到TAT-MS2-miR122 VLPs。結(jié)果顯示采用不同劑量的TAT-MS2-miR122 VLPs處理三種不同類型的細(xì)胞,均檢測(cè)到miR-122表達(dá)水平不同程度的升高,可持續(xù)穩(wěn)定約120小時(shí)。TAT-MS2-miR122 VLPs處理Hep3B細(xì)胞后,伴隨著miR-122水平的升高,Western Blot檢測(cè)到miR-122的兩個(gè)靶蛋白胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(Insulin-like growth factor 1 receptor, IGF1R)和去整合素樣金屬蛋白酶10(Adisintegrin and metalloproteinase 10, ADAM 10)表達(dá)水平下降。IGF1R和ADAM1 0均在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,兩種蛋白表達(dá)下降將影響Hep3B細(xì)胞的生長(zhǎng)。細(xì)胞增殖和凋亡實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了TAT-MS2-miR122 VLPs處理的細(xì)胞與陰性對(duì)照組相比,細(xì)胞增殖明顯受到抑制、凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增多,可見升高的miR-122發(fā)揮了抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。綜上所述,體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明展示穿透肽HIV-1 TAT的重組MS2 VLPs是有效的miRNAs遞送載體,該方法制備簡(jiǎn)單、成本低、產(chǎn)物穩(wěn)定、細(xì)胞攝取率高,具有良好的應(yīng)用前景。TAT-MS2-miR122 VLPs介導(dǎo)的miR-122升高能否在動(dòng)物水平抑制腫瘤生長(zhǎng)有待進(jìn)一步研究。
[Abstract]:In order to improve the ability of detecting avian influenza virus in the laboratory and influenza surveillance network in China in March 2013 , there were 10 samples , including 6 positive samples including virus nucleic acid extraction , reverse transcription and amplification . In order to improve the testing ability of the National Hospital Laboratory and Influenza Surveillance Network Laboratory , the results were analyzed . In order to improve the national hospital laboratory and influenza surveillance network laboratory , the results were analyzed . In order to improve the national hospital laboratory and influenza surveillance network laboratory , the results were analyzed .
A recombinant MS2VLPs - TAT - MS - 2 - miR122 VLPs , which was used as a carrier for the detection of HIV - 1 TAT in Hep3B cells , was prepared by modifying the expression plasmid of the tumor - related target protein .
The results showed that the expression of IGF - 2 - miR122 VLPs was significantly inhibited and the number of apoptotic cells increased . The results showed that the expression of IGF - 2 - miR122 VLPs was significantly inhibited and the number of apoptotic cells increased .
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R440

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 樊嘉;潘奇;史穎弘;;美國、亞太和中國肝癌共識(shí)比較[J];臨床肝膽病雜志;2011年04期

2 陳建國;;中國肝癌發(fā)病趨勢(shì)和一級(jí)預(yù)防[J];臨床肝膽病雜志;2012年04期

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本文編號(hào)：2105320