發(fā)布時(shí)間：2018-05-30 16:16

  本文選題：鏈置換等溫?cái)U(kuò)增 + 電化學(xué)傳感器�。� 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：研究背景微小核糖核酸(microRNA, miRNA)是近年來在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性具有調(diào)控功能的單鏈非編碼RNA,其長度約為19-25個(gè)核苷酸,主要發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控作用。目前已有研究證明,miRNA參與生命過程中的一系列重要活動(dòng),包括生長發(fā)育、免疫防御、造血過程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝、腫瘤發(fā)展、心臟發(fā)生等。雖然目前對已發(fā)現(xiàn)的miRNA分子功能和作用靶基因的研究還處于初步階段,但是從miRNA在不同組織和疾病的表達(dá)譜中分析發(fā)現(xiàn),某些miRNA在特定疾病中具有明顯的組織特異性。以上研究均表明,miRNA在疾病發(fā)生發(fā)展過程中存在非常重要的作用。miRNA的發(fā)現(xiàn)是臨床分子生物學(xué)革命性的突破,其高度的特異性和穩(wěn)定性決定了其作為一種新的疾病生物標(biāo)志物的巨大潛力。因此,找到一種適合的檢測方法顯得尤為重要。目前,檢測miRNA的常見方法包括印跡雜交、基因芯片、原位雜交以及熒光定量PCR。這些技術(shù)多需要復(fù)雜的步驟、昂貴的儀器以及較高的實(shí)驗(yàn)成本,在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。若發(fā)展一種適用于臨床實(shí)驗(yàn)室的miRNA檢測方法,應(yīng)滿足以下幾點(diǎn)要求：一.具備敏感的檢測能力,能定量檢測出極低豐度的不同臨床標(biāo)本中的miRNA;二.具備良好的特異性,能區(qū)分出高度同源的miRNA;三.檢測過程相對簡便,無需昂貴的設(shè)備和試劑。近年新發(fā)展起來的核酸鏈置換等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),無論是在實(shí)際操作還是儀器要求方面,都比目前常用技術(shù)更為簡單方便,它擺脫了對精良設(shè)備的依賴,在臨床基層和現(xiàn)場快速診斷中均顯示了良好的應(yīng)用前景。鏈置換等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)是指某些具有鏈置換活性的DNA聚合酶在延伸新鏈的過程中遇到下游DNA鏈,可以繼續(xù)延伸并同時(shí)將下游雙鏈剝離而產(chǎn)生游離的單鏈,其不需要特異性識別位點(diǎn)而在miRNA傳感器設(shè)計(jì)中得到廣泛應(yīng)用。然而,目前等溫?cái)U(kuò)增多需要光學(xué)檢測,此過程需要激發(fā)光源,可能會(huì)造成背景光的干擾,且熒光在外界環(huán)境易淬滅,再者單一的光學(xué)檢測法本身靈敏度有限,并不適合臨床特別是基層醫(yī)院的廣泛應(yīng)用。如何解決這些不足,成為等溫?cái)U(kuò)增領(lǐng)域的一個(gè)關(guān)鍵問題。生物傳感器由于集高效、靈敏、特異、小巧、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)于一身,目前也已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。與光學(xué)檢測方法相比,電化學(xué)傳感技術(shù)具有易微型化、選擇性好、背景值低、無熒光淬滅、成本低、樣品消耗少、便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)在核酸檢測方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢,且有效彌補(bǔ)了光學(xué)檢測法的不足。然而,傳統(tǒng)的電化學(xué)傳感器多利用信號放大提高靈敏度,由于中間沒有涉及到擴(kuò)增反應(yīng),多數(shù)方法并不能達(dá)到臨床實(shí)際樣本的檢測要求。如何進(jìn)一步提高靈敏度,成為電化學(xué)傳感技術(shù)領(lǐng)域的一個(gè)關(guān)鍵問題。綜上所述,鏈置換等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)能夠?qū)怂徇M(jìn)行數(shù)量擴(kuò)增增加方法的靈敏度,電化學(xué)傳感技術(shù)能有效的彌補(bǔ)等溫?cái)U(kuò)增光學(xué)檢測易淬滅背景高等方面的不足,且能通過信號放大進(jìn)一步增加方法的靈敏度�；诖�,我們提出了一個(gè)方案,鏈置換等溫?cái)U(kuò)增與電化學(xué)傳感聯(lián)用檢測miRNA。該方案利用磁性納米粒子作為液相檢測的微載體,通過在微載體上綁定具有莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的探針,當(dāng)體系中的靶miRNA與微載體上的探針結(jié)合后,探針打開。此時(shí),引物與聚合酶順利連接到探針上,在dNTP存在的條件下發(fā)生延伸反應(yīng),生物素標(biāo)記的dCTP連接到雙鏈DNA上,而被置換下來的靶miRNA與另一條探針結(jié)合,啟動(dòng)新一輪循環(huán)。待反應(yīng)一段時(shí)間后,終止等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。隨后,添加鏈霉親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶(streptavidin-alkaline phosphatase, Sa-ALP),通過磁性分離從而在磁性微粒上標(biāo)記有大量的酶,酶促產(chǎn)物抗壞血酸(L-ascorbic acid, AA)在電極上被氧化為脫氫抗壞血酸,產(chǎn)生可被檢測出的氧化峰電流。研究目的鏈置換等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、電化學(xué)傳感技術(shù)聯(lián)用建立一種快速、高效、特異且操作簡單的miRNA檢測方法,并對該方法進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)。完成一定樣本量的組織miRNA檢測并進(jìn)行初步臨床應(yīng)用評價(jià),為miRNA電化學(xué)檢測提供新思路。研究方法1.鏈置換等溫?cái)U(kuò)增-電化學(xué)聯(lián)用體系可行性探討1.1采用Beacon designer軟件對靶序列(目前暫定miR-21)設(shè)計(jì)特異型莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)探針,瓊脂糖凝膠電泳篩選與靶miRNA標(biāo)準(zhǔn)品特異結(jié)合的探針。1.2構(gòu)建鏈置換等溫?cái)U(kuò)增體系,測其熒光驗(yàn)證等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)是否能夠順利進(jìn)行。1.3根據(jù)生物配體的氨羧絡(luò)合反應(yīng)將氨基修飾的寡核苷酸探針(捕獲探針)固定在羧基修飾的磁珠表面,對液相等溫?cái)U(kuò)增體系進(jìn)行共聚焦表征觀察探針是否順利連接到納米磁珠表面。1.4利用循環(huán)伏安法(cyclic voltammetry, CV)對各個(gè)步驟的納米磁珠進(jìn)行表征。1.5將生物素化的dCTP摻和至等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物,探討生物素化dCTP對等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的影響。瓊脂糖凝膠電泳對等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離、鑒定,并選擇理想biotin-dCTP的添加比例。2.基于鏈置換等溫?cái)U(kuò)增／酶促電化學(xué)的miRNA基因傳感器體系構(gòu)建及其方法學(xué)初步評價(jià)2.1比較不同探針濃度、酶量、稀釋比、孵育時(shí)間等條件下,所產(chǎn)生電信號的變化,優(yōu)化出最佳反應(yīng)條件。2.2在此反應(yīng)條件下,通過對液相中標(biāo)準(zhǔn)品miRNA的實(shí)時(shí)監(jiān)測,深入解析液相中生物分子反應(yīng)時(shí)傳感器的響應(yīng)機(jī)制,計(jì)算出一系列雜交動(dòng)力學(xué)常數(shù),通過傳感器等效電路分析法建立數(shù)學(xué)模型。2.3驗(yàn)證該基因傳感器鑒定錯(cuò)配的能力。2.4以目前miRNA檢測常用方法——熒光定量PCR為參考方法,對其進(jìn)行臨床應(yīng)用初步評價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.合成并純化針對miR-21特異序列的氨基修飾的莖環(huán)狀探針,用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證了其特異性。多功能酶標(biāo)儀熒光圖驗(yàn)證了在phi29DNA聚合酶的參與下鏈置換等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)得以順利進(jìn)行。空白磁性微載體(magnetic microcarrier, MMC)與磁性微載體-莖環(huán)狀探針(magnetic microcarrier- molecular beacon, MMC-MB)的激光共聚焦熒光結(jié)果證明了經(jīng)氨羧絡(luò)合反應(yīng)探針能順利連接到磁珠表面。CV結(jié)果表明隨著反應(yīng)的不斷進(jìn)行,納米粒子表面不斷連接上新的物質(zhì)。最后,又通過摻入不同比例的生物素成功驗(yàn)證了生物素?fù)饺敕m影響反應(yīng)速率,但不影響反應(yīng)順利進(jìn)行。2.在本文第一部分成功驗(yàn)證了構(gòu)建方法關(guān)鍵步驟可行性的基礎(chǔ)上,通過條件優(yōu)化測得miRNA電化學(xué)基因傳感體系在miRNA目的序列濃度為10-14M-10-8M范圍內(nèi),氧化峰電流改變值與miR-21濃度的對數(shù)呈線性關(guān)系,該方法檢測限為9fM,并證實(shí)了其能夠在電化學(xué)平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)對目的序列的特異性識別,且能夠區(qū)分一個(gè)堿基的差異。最后,利用本方法檢測組織中miR-21的表達(dá)量,其結(jié)果與熒光定量PCR結(jié)果具有良好的一致性,初步驗(yàn)證了該方法的檢測效能。結(jié)論鏈置換等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)-酶促反應(yīng)電化學(xué)傳感器聯(lián)用構(gòu)建核酸多酶標(biāo)記體系,分別從數(shù)量擴(kuò)增、放大電流信號兩方面增加分析的靈敏度。該方法不需逆轉(zhuǎn)錄,檢測時(shí)間短,不需大型儀器,適用于臨床特別是基層醫(yī)院廣泛開展。該方法具有較高特異性與靈敏度(檢測限9fM),在低水平miRNA的檢測以及電化學(xué)芯片的研制方面具有一定理論意義和潛在的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。通過檢測臨床組織樣本miRNA,驗(yàn)證了該方法的檢測效能,為構(gòu)建一種高敏、快速、經(jīng)濟(jì)、簡便的電化學(xué)miRNA檢測技術(shù)提供新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:Microribonucleic acid ( miRNA ) is a kind of single - stranded non - coding RNA which has been found in eukaryotic organisms in recent years . Its length is about 19 - 25 nucleotides . It plays a very important role in the development of the disease . The invention provides a method for detecting miRNA by using magnetic nanoparticles as liquid phase detection . In this paper , the effect of biotin - mediated isothermal amplification ( CV ) on isothermal amplification reaction was investigated . The results showed that the probe could be successfully connected to the surface of magnetic beads by means of cyclic voltammetry . Rapid , economical and simple electrochemical miRNA detection technology provides a new experimental basis .
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R440

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1955925