本文選題：實(shí)時(shí)熒光定量PCR + 肺炎克雷伯菌��； 參考：《浙江大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：研究背景 肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, Kpn)屬于腸桿菌科克雷伯菌屬,最早由Friediander于1893年從大葉性肺炎患者的肺組織中首次分離到�？死撞鸀楦锾m陰性桿菌,無(wú)鞭毛,無(wú)芽孢,在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上可形成莢膜。多數(shù)菌株有菌毛,具有菌體抗原、莢膜抗原、菌毛抗原等多種主要抗原成分。該菌為兼性厭氧菌,營(yíng)養(yǎng)要求不高,在培養(yǎng)基上可形成較大、凸起、灰白色粘液型的菌落。 典型的肺炎克雷伯菌是一種條件致病菌,它能使免疫力低的人群易獲得醫(yī)院感染。該菌在正常人口咽部的帶菌率為1%-6%,但在住院病人中可高達(dá)20%,是糖尿病病人和慢性阻塞性肺病患者并發(fā)肺部感染的潛在危險(xiǎn)因素。近年來(lái),由于這些典型的肺炎克雷伯菌株出現(xiàn)了耐藥情況,且呈上升趨勢(shì),使得該菌在臨床治療上極為棘手。最近有報(bào)道稱(chēng),一種新的高毒性的肺炎克雷伯菌變種已經(jīng)出現(xiàn),它的臨床特征為能在年輕的健康人群中引發(fā)嚴(yán)重的、威脅生命的社區(qū)獲得性感染。這些感染包括肝膿腫、肺炎、腦膜炎、感染性眼內(nèi)炎和轉(zhuǎn)移性葡萄膜炎。如果這些菌株也出現(xiàn)了耐藥趨勢(shì),那么臨床治療將會(huì)面臨巨大的挑戰(zhàn)。因此,臨床迫切需要一種快速,準(zhǔn)確和簡(jiǎn)便的方法來(lái)鑒定出病原菌,以輔助臨床選擇有效的抗生素來(lái)減少致死率和耐藥菌株的出現(xiàn)。 細(xì)菌培養(yǎng)鑒定是目前常用的檢測(cè)肺炎克雷伯菌的方法,一般需要經(jīng)過(guò)分離培養(yǎng),生化反應(yīng)鑒定,血清學(xué)鑒定,腸毒素測(cè)定等步驟。盡管臨床上已有半自動(dòng)和全自動(dòng)微生物鑒定和藥敏系統(tǒng)(例如Vitek系統(tǒng)),但整個(gè)培養(yǎng)鑒定過(guò)程至少需要48-72小時(shí),耗時(shí)耗力,不能滿足目前臨床快速診斷的要求。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是目前常用的分子診斷技術(shù),與常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法比較,它具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、大批量檢測(cè)、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。本研究旨在建立檢測(cè)肺炎克雷伯菌的熒光定量PCR方法,對(duì)其敏感性、特異性等進(jìn)行評(píng)價(jià),并應(yīng)用此方法對(duì)臨床疑似肺炎克雷伯菌感染的患者的痰液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法： 1建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肺炎克雷伯菌的方法,通過(guò)檢測(cè)不同濃度梯度的肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC700603),15種非肺炎克雷伯菌及重復(fù)檢測(cè)低、中、高三個(gè)濃度的肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC700603)來(lái)評(píng)價(jià)其線性、敏感性、特異性及精密度。 2收集2014年3月至7月期間浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院疑似肺炎克雷伯菌感染住院病人255例痰液標(biāo)本。用建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)標(biāo)本,與細(xì)菌培養(yǎng)法比較,分析敏感性和特異性。 結(jié)果： 1已建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法在肺炎克雷伯菌濃度103-107copies/ml范圍內(nèi)有良好的線性,線性相關(guān)系數(shù)為0.998。 2實(shí)時(shí)熒光定量PCR法的最低檢測(cè)限為1×103copies/ml。 3本方法檢測(cè)其它常見(jiàn)致病菌(金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、甲型溶血性鏈球菌、綠膿桿菌、大腸埃希桿菌等)均為陰性,無(wú)交叉反應(yīng),證實(shí)有較好的特異性。 4實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)低、中、高三個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測(cè)的結(jié)果如下：低濃度三次批內(nèi)變異系數(shù)分別為1.05%、1.17%、1.11%,批間變異系數(shù)為1.26%；中濃度三次批內(nèi)變異系數(shù)分別為1.23%、2.84%、1.66%,批間變異系數(shù)為1.97%；高濃度三次批內(nèi)變異系數(shù)分別為1.01%、1.15%、1.25%,批間變異系數(shù)為1.28%。 5實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)255例臨床痰標(biāo)本中,檢測(cè)出82例肺炎克雷伯菌陽(yáng)性(陽(yáng)性檢出率為32.16%,),細(xì)菌培養(yǎng)鑒定出69例陽(yáng)性(陽(yáng)性檢出率為27.06%)。兩種方法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 結(jié)論： 成功建立檢測(cè)肺炎克雷伯菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,該方法是一種敏感、特異、精密度高的檢測(cè)肺炎克雷伯菌的方法。與傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)鑒定法相比,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法的陽(yáng)性檢出率略高,檢測(cè)速度快,人力花費(fèi)少。該方法的建立為臨床診斷肺炎克雷伯菌感染提供了新的快速檢測(cè)方法。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R440

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1744028