本文選題：基因治療　切入點：陽離子脂質(zhì)體　出處：《第二軍醫(yī)大學》2015年碩士論文

【摘要】：陽離子脂質(zhì)體作為非病毒載體被大量應(yīng)用于基因治療,但是其毒性作用始終限制著其應(yīng)用。于是探索其毒性機制變得尤為關(guān)鍵。我們的研究將試圖闡明其毒性機制。我們的數(shù)據(jù)顯示陽離子脂質(zhì)體對肝癌細胞的細胞毒性是劑量依賴的,并伴隨活性氧上調(diào)和線粒體損傷,這種損傷可以被活性氧清除劑N-乙酰半胱氨酸逆轉(zhuǎn)。進一步數(shù)據(jù)揭示陽離子脂質(zhì)體早期2小時激活自噬然后最終阻斷自噬,這種調(diào)控是mTOR非依賴的。我們通過LC3-II和P62,GFP-LC3熒光,Cyto-ID染色和雙熒光RFP-GFP-LC3多角度驗證這種現(xiàn)象,接下來我們通過acridine orange和LysoTracker-Red染色發(fā)現(xiàn)autophagosome-lysosome融合受到影響。然后我們發(fā)現(xiàn)CLs可以導(dǎo)致溶酶體受損,表現(xiàn)為變肥大,溶酶體降解能力受損科溶酶體堿化。最后,通過藥物和基因ATG7下調(diào)可以重現(xiàn)CLs的效應(yīng):細胞毒性效應(yīng),ROS上調(diào)和線粒體損傷。綜合上述,我們的研究揭示了CLs通過阻斷自噬引起細胞毒性,同時伴隨線粒體損傷和ROS上調(diào)。我們的研究可以幫助以后評估納米顆粒的生物兼容性以及涉及更好的基因遞送載體有更好的意義。基因治療是指在細胞中插入,修改或者敲除特殊基因來治療疾病。它對于治療多種疾病具有很大潛力�；蛑委熥铌P(guān)鍵的就是高效和安全。兩種主要的方法是病毒介倒的和非病毒介倒,相對于病毒治療,非病毒方法相對安全和簡單,非病毒方法組要有陽離子脂質(zhì)體,多肽和高分子聚合物,且已經(jīng)使用多年。其中陽離子脂質(zhì)體是最北廣泛使用的非病毒載體。盡管它比病毒載體毒性要小,但也不是完全沒有毒性,這也限制了其體內(nèi)外基因治療的范圍。到目前為止,只有1篇15年1月份的研究闡述了陽離子脂質(zhì)體通過損害引發(fā)肺細胞系的Na+/K+-ATP泵導(dǎo)致細胞壞死。所以,陽離子導(dǎo)致細胞毒性的潛在機制依舊不明確。自噬是一種自我消化的過程,將胞漿內(nèi)容物和顆粒包裹在雙層膜結(jié)構(gòu)中然后運輸?shù)饺苊阁w降解和再循環(huán)。自噬是一種細胞死亡的必須調(diào)控途徑,它是腫瘤細胞抵抗應(yīng)激(如饑餓)的一種自我保護和生存機制,所以促進腫瘤發(fā)生和藥物抵抗。因為自噬是細胞的重要生存機制,所以抑制其可能產(chǎn)生細胞毒性。最近,大量的納米顆粒包括陽離子脂質(zhì)體被報道可以產(chǎn)生自噬,總體說來,大多數(shù)納米顆粒被認為是自噬激活劑,納米顆粒激活自噬引發(fā)細胞死亡已經(jīng)被大量研究證實。但是,納米顆粒在自噬調(diào)控中只作為激活劑最近卻一直被反對,首先,自噬體積累可能預(yù)示著自噬激活或者自噬抑制,所以僅僅評估自噬體LC3的量是不夠的。有個詞語叫“自噬流”被用來代表自噬的動態(tài)發(fā)展過程:自噬小體形成,成熟,和溶酶體融合,降解。它可以更好的來評估自噬激活和抑制。納米顆粒自噬-2-抑制的研究鮮有報道,所以許多案例中的激活情況也就不確定。事實上,在那些自噬流被研究的研究中,自噬流抑制在納米金,富勒烯和其衍生物的生物效應(yīng)中已經(jīng)報道產(chǎn)生過。其次,諸如陽離子脂質(zhì)體等納米顆粒的毒性作用以及在很多研究中報道過。相反,大多數(shù)研究說明自噬是一種腫瘤細胞的保護機制而不是細胞死亡途徑。還沒有足夠的證據(jù)證明自噬是一種細胞死亡誘導(dǎo)劑。有個通過化學或者基因抑制凋亡的人工模型顯示了在細胞死亡中的角色,所以自噬在程序性細胞死亡中的角色是有爭議的,納米顆粒通過抑制細胞這種自我保護機制導(dǎo)致細胞毒性是有待研究的。基于以上的背景,我們假設(shè)陽離子脂質(zhì)體的毒性可能是由于抑制自噬流導(dǎo)致的。陽離子脂質(zhì)體對自噬流的影響目前為止只有2個研究報道:Roberts R發(fā)現(xiàn)陽離子脂質(zhì)體引發(fā)自噬,Man N等發(fā)現(xiàn)陽離子脂質(zhì)體激活自噬是mTOR非依賴的。我們需要注意的是自噬流是一個動態(tài)過程,也就是說自噬流可能在一段時間區(qū)間內(nèi)激活阻斷交替出現(xiàn),預(yù)示著應(yīng)該多個時間點來評估自噬,所以,我們假設(shè)陽離子脂質(zhì)體可能可能是動態(tài)調(diào)控自噬的:也就是陽離子脂質(zhì)體早期激活自噬流然后晚期將其阻斷,陽離子脂質(zhì)體產(chǎn)生的細胞毒性是由于其抑制了自噬這一腫瘤細胞的自我保護機制。為了闡明陽離子脂質(zhì)體細胞毒性的潛在機制,我們細致研究了陽離子脂質(zhì)體細胞毒性,陽離子脂質(zhì)體對人肝臟表皮細胞系(因為大部分納米顆粒主要累計在肝臟)自噬流的影響。我們的結(jié)果揭示了陽離子通過阻斷自噬來引起細胞毒效應(yīng),同時伴隨線粒體損傷和活性氧上調(diào),我們的數(shù)據(jù)揭示了陽離子脂質(zhì)體的細胞毒性機制,從而對今后研究安全的基因遞送載體系統(tǒng)有更好的啟示作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R450

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本文編號：1717748