本文關(guān)鍵詞： 非病毒基因載體 聚乙烯亞胺 靶向 核定位信號肽 細胞穿膜肽　出處：《上海海洋大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：基因治療作為近年來興起的新型治療方法,針對腫瘤的發(fā)病根源,從分子水平將治療基因?qū)肴梭w靶細胞,隨著基因的表達執(zhí)行對腫瘤的殺傷或抑制,從而達到治療目的。相比傳統(tǒng)治療,基因治療是最有可能從根本上根除腫瘤的方法�；蛑委熕鎸Φ淖畲笃款i是缺乏有效的運送載體。非病毒基因載體因其化學(xué)結(jié)構(gòu)可控、易于大量制備、不限制載體容量、低毒低免疫反應(yīng)等優(yōu)點,已成為本領(lǐng)域的研究熱點。陽離子聚合物聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI)由于具有相對較高的轉(zhuǎn)染效率,成為近年來研究的熱點。但大量研究表明,PEI要作為臨床治療工具,仍存在三個問題需要解決:1.毒性和轉(zhuǎn)染效率之間的矛盾。高分子量的PEI(high molecular weight polyethyleneimine,HMW PEI)具有高的轉(zhuǎn)染效率,但與此同時,存在毒性強的缺點,反之低分子量PEI(low molecular weight polyethyleneimine,LMW PEI)雖然毒性小,但低轉(zhuǎn)染效率又成為其限制條件;2.缺乏特異的腫瘤靶向性。PEI依靠其表面攜帶的大量正電荷與細胞結(jié)合,缺乏對腫瘤細胞的特異選擇性,限制其轉(zhuǎn)染效率進一步提高;3.體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率較低。期冀基因治療最終能夠應(yīng)用于臨床,但目前PEI或者PEI衍生物的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率遠遠低于體外。為了解決PEI作為基因載體存在的三個問題,本課題同時從三個點切入,設(shè)計合成了一種新型的非病毒載體。首先以低分子量PEI(2 KDa)作為載體骨架,利用改性的兩親性殼聚糖OTMCS交聯(lián)低分子量PEI得到高分子量PEI衍生物OTMCS-PEI。同時連接能特異結(jié)合腫瘤細胞及其新生血管高表達的整合素αvβ3的RGD肽、細胞穿膜肽TAT(49-57)、核定位信號肽NLS,設(shè)計合成一種能靶向于腫瘤細胞,促進穿膜并提高核遞送能力的三功能肽RGD-TAT-NLS(命名為R18)。利用交聯(lián)技術(shù)將OTMCS-PEI與R18偶聯(lián),合成新型非病毒基因載體OTMCS-PEI-R18。本文評價了該載體的理化性質(zhì)和體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率,并初步探究了該載體系統(tǒng)的入胞及胞內(nèi)運轉(zhuǎn)機理。為了呈現(xiàn)直觀的評價效果,PEI 25 KDa、OTMCS-PEI、OTMCS-PEI-R13作為實驗對照。本文第一部分,探討了PEI作為非病毒基因載體的研究現(xiàn)狀,在研究過程中存在的主要問題,并討論了可能的優(yōu)化策略。第二部分,OTMCS-PEI-R18的合成及表征。首先采用固相法制備三功能肽R18,并通過電噴霧質(zhì)譜分析(MS)鑒定其序列,高效液相(HPLC)測定其相對百分含量,由MS及HPLC分析知,已按照設(shè)計序列成功合成了純度為95.56%多肽R18。將活化的兩親性殼聚糖OTMCS與PEI 2 KDa連接形成OTMCS-PEI高分子聚合物,利用SMCC及半胱氨酸(Cys)的巰基將R18與OTMCS-PEI偶聯(lián)得到最終產(chǎn)物OTMCS-PEI-R18。由氫核磁共振(1H-NMR)分析知三功能肽R18已成功偶聯(lián)于OTMCS-PEI聚合物分子上。第三部分,考察了OTMCS-PEI-R18的理化性質(zhì)。利用凝膠滲透層析色譜法(GPC)測定經(jīng)不同時長37℃孵育后水解產(chǎn)物的分子量大小,評價其水解性能;利用Zeta電位儀測定其粒徑大小及表面電位;使用酸堿滴定法及透射電鏡考察陽離子聚合物的緩沖能力和聚陽離子/DNA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)形態(tài);借助瓊脂糖凝膠電泳,考察陽離子聚合物對DNA的包合及保護能力;以Hela細胞,B16細胞為工具細胞,采用MTT法考查OTMCS-PEI-R18/DNA復(fù)合物的細胞毒性。結(jié)果表明,聚合物在37℃下能夠逐漸水解,最終(60 h)水解為小分子物質(zhì)。透射電鏡下可觀察到復(fù)合物呈類球形,粒徑約150-450 nm,電位適中,緩沖能力良好。OTMCS-PEI-R18與DNA質(zhì)量比約為為1.0時可將DNA完全包裹,并保護DNA抵抗高濃度肝素鈉、DNase I及血清的解離,細胞毒性與PEI 25 KDa相比顯著降低。第四部分,從體外(細胞)、體內(nèi)(動物)兩方面考察OTMCS-PEI-R18/DNA復(fù)合物體的轉(zhuǎn)染效率。以綠色熒光蛋白質(zhì)粒(p EGFP-N2)和螢火蟲熒光素酶質(zhì)粒(p GL3-Control)為報告基因,考察復(fù)合物對Hela細胞和B16細胞的轉(zhuǎn)染能力。并建立小鼠腫瘤模型,以螢火蟲熒光素酶質(zhì)粒(p GL3-Control)為報告基因,考察熒光素酶在各組織的表達和分布情況。結(jié)果表明,OTMCS-PEI-R18/DNA復(fù)合物的體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率明顯高于對照組,隨著陽離子聚合物質(zhì)量比增大,轉(zhuǎn)染效率逐漸升高,同時隨著三功能肽R18的投料比增大,體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率也隨之提高。更值得關(guān)注的是,偶聯(lián)R18后,報告基因在體內(nèi)的分布得到了改善,更多的聚集于腫瘤組織,螢火蟲熒光素酶在腫瘤的表達量明顯高于其他組織。第五部分,OTMCS-PEI-R18/DNA復(fù)合物胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的初步研究。借助不同內(nèi)吞途徑抑制劑、胞內(nèi)運轉(zhuǎn)抑制劑,考察復(fù)合物的內(nèi)吞、細胞質(zhì)內(nèi)運轉(zhuǎn)及入核途徑;采用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標(biāo)記OTMCS-PEI-R18,借助激光共聚焦顯微鏡實時考察復(fù)合物在細胞內(nèi)的分布。結(jié)果表明,由受體介導(dǎo)的入胞途徑及胞內(nèi)運轉(zhuǎn)被抑制后,與OTMCS-PEI、OTMCS-PEI-R13相比,OTMCS-PEI-R18/DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率明顯減低,表明連接R18后,轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)更多的依賴于受體介導(dǎo)途徑入胞轉(zhuǎn)運;而細胞分裂活動被抑制后,OTMCS-PEI-R18/DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率則高于未連接R18的情況,表明該復(fù)合物的入核過程不依賴細胞分裂,更適合于體內(nèi)的非分裂細胞轉(zhuǎn)染。激光共聚焦實驗也證實連接R18后,復(fù)合能夠大量的聚集于細胞核。本課題通過雙親性殼聚糖連接LMW PEI獲得PEI衍生物,并設(shè)計具有靶向腫瘤、促進穿膜及核遞送特性的三功能肽R18,利用交聯(lián)技術(shù)將之偶聯(lián)于OTMCS-PEI,獲得新型非病毒基因載體OTMCS-PEI-R18。該載體細胞毒性低,轉(zhuǎn)染效率高,特別是體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率明顯提高,并且顯示了良好的腫瘤靶向性。機制研究證明了其受體介導(dǎo)的特異性入胞及運轉(zhuǎn)方式,適宜體內(nèi)非分裂細胞的轉(zhuǎn)染。
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【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R450

【參考文獻】

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本文編號：1495702