本文關(guān)鍵詞： 缺氧缺血性腦損傷 新生豬 水通道蛋白 4 基因沉寂 磁共振　出處：《大連醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：新生兒缺血缺氧性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是引起新生兒急性死亡和兒童智力低下、腦癱和癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要原因之一,而腦水腫是腦細(xì)胞死亡的早期病理改變,其有效防治臨床意義重大。水通道蛋白4(aquaporin-4,AQP4)在腦水平衡和中樞滲透壓調(diào)解中起重要作用,是腦水腫發(fā)生、發(fā)展的決定性因素。近十年基因治療的研究進(jìn)展迅速,新生大鼠AQP4基因敲除可減輕水中毒和局部缺血缺氧所引起的腦水腫癥狀,這為腦水腫的治療提供了新的思路。但基因治療的評(píng)價(jià)方法仍然難以令人滿意,如何對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行無(wú)創(chuàng)傷的評(píng)價(jià)是基因治療所必須面對(duì)的關(guān)鍵問(wèn)題。磁共振擴(kuò)散成像(diffusion weighted imaging,DWI)是目前在活體上進(jìn)行水分子擴(kuò)散測(cè)量與成像的唯一方法,并提供可以量化的表觀彌散系數(shù)(apparent diffuse coefficient,ADC),這為在活體完整的微循環(huán)狀態(tài)下研究腦水腫病理機(jī)制及評(píng)價(jià)基因治療效果開(kāi)辟了一條新路。RNA干擾技術(shù)(RNAi)是近年來(lái)產(chǎn)生的特異性基因阻斷生物技術(shù),能夠快速、高效地下調(diào)特異基因的表達(dá),是一種簡(jiǎn)單地可代替基因敲除的分子生物學(xué)研究工具。為了進(jìn)一步在活體研究AQP4在HIE腦水腫形成中的作用機(jī)制及評(píng)估AQP4基因沉寂對(duì)缺血缺氧性腦水腫的治療效果,我們擬用生后3~5天的約克種豬為動(dòng)物模型,建立新生豬缺血缺氧腦損傷模型,利用RNA干擾技術(shù),通過(guò)腦脊液注射給藥途徑將siRNA導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi),采用3.0T磁共振掃描儀觀察缺血缺氧后不同時(shí)間的腦MRI變化,為研究HIE腦水腫的發(fā)生機(jī)制及治療方法尋求新線索。目的1.觀察新生豬急性缺氧缺血腦損傷(hypoxicschemic brain damage,HIBD)早期DWI圖像及ADC值的變化規(guī)律。2.探討新生豬早期HIBD過(guò)程中ADC值與AQP4表達(dá)的相關(guān)性3.探討DWI活體評(píng)價(jià)AQP4基因沉寂對(duì)新生豬HIBD的治療效果。方法1.選擇新生約克豬隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組10只,對(duì)照組12只,實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行hibd模型制備,對(duì)照組僅行假手術(shù),分別在缺氧缺血前及缺氧缺血后1h、3h、6h、9h和12h進(jìn)行常規(guī)mr掃描和dwi檢查,得到tiwi、t2wi、t2-flair、dwi圖像和相應(yīng)adc圖,觀察圖像變化,并選擇皮層及皮層下、側(cè)腦室旁區(qū)、海馬區(qū)三部分進(jìn)行adc值測(cè)量,實(shí)驗(yàn)組在缺血缺氧后各時(shí)間點(diǎn)mr檢查后各處死2只,取腦做病理學(xué)檢查,處死前做神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。2.選擇新生約克豬隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組各24只,實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行hibd模型制備,對(duì)照組僅行假手術(shù),分別在缺氧缺血前及缺氧缺血后1h、3h、6h、9h和12h進(jìn)行mr掃描,得到dwi圖像和相應(yīng)adc圖,觀察dwi圖像變化,并選擇皮層及皮層下、側(cè)腦室旁區(qū)、海馬區(qū)三部分進(jìn)行adc值測(cè)量,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照在缺血缺氧后各時(shí)間點(diǎn)mr檢查后各處死4只,取腦做免疫組織化學(xué)分析,檢測(cè)aqp4蛋白表達(dá)情況。3.選擇新生約克豬隨機(jī)分為a組(實(shí)驗(yàn)組)11只,b組(對(duì)照組1)11只,c組(對(duì)照組2)6只,d組(對(duì)照組3)4只。a組給予腦脊液注射sirna-aqp4和缺血缺氧,b組給予腦脊液注射sirna-negative(aqp4非干擾序列)和缺血缺氧,c組給予腦脊液注射sirna-negative(aqp4非干擾序列)和假手術(shù),d組不做任何處理。各組分別在缺氧缺血前及缺氧缺血后1h、3h、6h、9h和12h進(jìn)行mr掃描,得到dwi圖像和相應(yīng)adc圖,觀察dwi圖像變化,并選擇皮層及皮層下、側(cè)腦室旁區(qū)、海馬區(qū)三部分進(jìn)行adc值測(cè)量,并進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分,各組動(dòng)物均在12h后取腦,然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析及realtimepcr檢查,檢測(cè)aqp4蛋白及aqp4mrna表達(dá)情況,缺血缺氧前及缺血缺氧后12h抽取動(dòng)脈血行血?dú)饧澳X酶學(xué)檢查。結(jié)果1.實(shí)驗(yàn)組在缺血缺氧后各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分較對(duì)照組降低顯著(p0.05),新生豬hibd模型制備成功,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組tiwi、t2wi、t2-flair圖像均未見(jiàn)異常信號(hào)。實(shí)驗(yàn)組在缺血缺氧后1h,dwi圖像上開(kāi)始出現(xiàn)點(diǎn)狀高信號(hào)區(qū),隨時(shí)間延長(zhǎng),在缺血缺氧后3h、6h、9h各點(diǎn)的dwi圖像上,高信號(hào)區(qū)范圍和強(qiáng)度明顯擴(kuò)大,主要分布于大腦皮層、側(cè)腦室旁區(qū)及海馬區(qū),缺血缺氧后12h,dwi圖像顯示腦內(nèi)呈彌漫性高信號(hào)改變。實(shí)驗(yàn)組各部位ADC值1h下降明顯,3h最低,6h、9h、12hADC值回升,但仍明顯低于缺血缺氧前ADC水平。對(duì)照組在不同時(shí)間DWI圖像及ADC值未見(jiàn)異常改變。在缺血缺氧后1h、3h、6h、9h及12h,實(shí)驗(yàn)組ADC值較對(duì)照組ADC值降低,差異顯著(P0.05)。病理學(xué)顯示缺血缺氧后1h部分細(xì)胞內(nèi)即出現(xiàn)水腫,3h細(xì)胞內(nèi)水腫加重,范圍增大,6h出現(xiàn)少許血管源性水腫,至12h,血管源性水腫逐漸加重,但仍以細(xì)胞內(nèi)水腫為主。2.免疫組織化學(xué)分析顯示,實(shí)驗(yàn)組側(cè)腦室旁區(qū)、海馬區(qū)AQP4蛋白在缺血缺氧后1h、3h、6h、9h、12h各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量較對(duì)照組增多,差異顯著(P0.05),并與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)ADC值呈負(fù)相關(guān)(P0.05)。3.A組、C組、D組在各時(shí)間點(diǎn)DWI圖像上未見(jiàn)明顯異常高信號(hào),B組在各時(shí)間點(diǎn)DWI表現(xiàn)同前兩項(xiàng)研究結(jié)果,A組各部位ADC值在缺血缺氧后各時(shí)間點(diǎn)輕微降低,12h幾乎恢復(fù)正常,較B組各時(shí)間點(diǎn)ADC值增高,差異顯著(P0.05)。神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分顯示:A組在缺血缺氧后各時(shí)間點(diǎn)較B組評(píng)分增高,差異顯著(P0.05)。免疫組織化學(xué)檢查顯示A組較B組AQP4蛋白著色細(xì)胞數(shù)量減少,Real Time PCR檢查結(jié)果顯示:A組海馬區(qū)較B組海馬區(qū)AQP4mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯減少,差異顯著(P0.05);A組側(cè)腦室旁區(qū)較B組側(cè)腦室旁區(qū)AQP4mRNA相對(duì)表達(dá)量減少,但差異不顯著(P=0.25);A、B組海馬區(qū)AQP4mRNA相對(duì)表達(dá)量較側(cè)腦室旁區(qū)增多,差異顯著(P0.05)。結(jié)論1.DWI是新生豬HIBD早期影像檢查中敏感、有效的檢查方法,ADC值的變化較DWI圖像更能反映HIBD早期的病理生理變化。2.AQP4在新生豬HIBD早期過(guò)程中高表達(dá),并與ADC值呈顯著負(fù)相關(guān)。3.RNAi可有效抑制新生豬缺血缺氧后AQP4基因表達(dá),減輕HIBD癥狀,可作為基因治療的有效手段。4.海馬區(qū)AQP4表達(dá)較側(cè)腦室旁區(qū)增多,可作為海馬較其它部位對(duì)缺血缺氧敏感的基礎(chǔ)之一。5.ADC值測(cè)量可作為活體動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)AQP4基因沉寂治療HIBD的有效方法。
[Abstract]:In order to study the effect of AQP4 gene therapy on brain edema and to evaluate the effect of AQP4 gene silencing on hypoxic - ischemic brain edema , it is a key issue to study the effect of AQP4 gene silencing on brain edema and to evaluate the effect of AQP4 gene silencing on brain edema . The experimental group and control group were randomly divided into two groups ( experimental group ) . At 1 h , 3 h , 6 h , 9 h and 12 h after ischemia and hypoxia , the ADC values of the experimental group were significantly higher than those in the control group ( P0.05 ) . Conclusion 1 . DWI is a sensitive and effective method in the early stage of HIBD . Conclusion 1 . DWI is a sensitive and effective method in the early stage of HIBD .

【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R742;R445.2

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本文編號(hào)：1483533