發(fā)布時間：2018-01-13 05:03

  本文關(guān)鍵詞：馬爾尼菲青霉氟康唑耐藥機制的研究　出處：《廣西醫(yī)科大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關(guān)文章： 馬爾尼菲青霉 氟康唑 耐藥機制

【摘要】：目的氟康唑(Fluconazole, FLC)是我國臨床上治療馬爾尼菲青霉(Penicillium marneffei, PM)感染的常用抗真菌藥物,但臨床療效欠佳,體外藥敏示MIC值較高,考慮部分PM存在FLC耐藥的可能。本研究擬探討PM FLC耐藥與唑類藥物靶酶基因及藥物流出泵基因表達和功能的關(guān)系,了解PM對FLC不敏感的分子機制。方法 實驗菌株包括2株FLC臨床治療抵抗、體外藥敏提示FLC MIC較高的PM臨床耐藥株A1、A3；以PM標準株FRR2161為母本,通過在含F(xiàn)LC濃度≥64μg/ml培養(yǎng)基上誘導獲得的6株P(guān)M誘導株C2、C3、C4、B3、B4、B5；以及標準株FRR2161。在此基礎(chǔ)上,課題組進行了以下研究：(1)參照美國臨床和實驗室標準化研究所(clinical and laboratory standard institute, CLSI)的M38-A2方案并作適當修改,采用微量稀釋法測定實驗菌株對兩性霉素B (amphotericin B, AmB)、FLC、伊曲康唑(itraconazole,ITC)、伏立康唑(voriconazole, VOC)敏感性,并借鑒白念珠菌FLC藥敏判斷標準建立PM FLC藥敏標準；(2)在25℃時FLC耐藥株與標準株進行比較,觀察實驗菌株的表型特征、生長速率及產(chǎn)孢率；(3)做銅圈小培養(yǎng),觀察25℃時實驗菌株的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)；(4)提取標準株及FLC耐藥株的DNA,測定實驗菌株的ITS (Internal Transcribed Spacer)區(qū)序列,進行比對；(5)對實驗菌株用4種隨機引物P23、P103、P105、P120進行隨機擴增多態(tài)性分析(Randomly amplified polymorphic DNA, RAPD);(6)對實驗菌株的唑類藥物靶酶基因cyp51B進行測序,并與GenBank中公布的PM基因cyp51B序列進行比對；(7)提取實驗菌株的RNA,用real time PCR分別測定各菌株中唑類藥物靶酶基因cyp51B及相關(guān)藥物流出泵基因的相對表達量。(8)所得數(shù)據(jù)通過軟件SPSS16.0采用獨立樣本t檢驗進行比較,P0.05有統(tǒng)計學意義。結(jié)果 (1)建立PMFLC藥敏標準：選取FLC MIC值2.0～8.0μg/ml敏感,16～32μg/ml劑量依賴性敏感,大于或等于64μg/ml判斷為耐藥。實驗菌株除標準株FRR2161外,余菌株FLC MIC值范圍為128～256μg/ml,符合FLC耐藥判斷標準；實驗菌株均對AmB、ITC以及VOC敏感；(2)25℃時PM FLC耐藥株與標準株FRR2161相比,生長速率下降(P0.05)；(3)25℃銅圈小培養(yǎng)實驗示PM FLC耐藥株產(chǎn)分生孢子數(shù)相對標準株FRR2161降低；(4) PM FLC耐藥株和標準株FRR2161與GenBank上公布的PM ITS區(qū)序列完全一致；(5) RAPD實驗中,PM FLC誘導耐藥株與其母本標準株FRR2161比較,用4種隨機引物進行擴增,所得產(chǎn)物帶型完全一致,但其帶型與PM FLC I臨床耐藥株明顯不同；(6)實驗菌株存在藥物靶酶基因cyp51B不同堿基位點的突變,而造成相應氨基酸的替換：菌株C2、C4的靶酶基因cyp51B編碼區(qū)有T1583C的點突變,導致14α脫甲基酶第440位的絡(luò)氨酸被組氨酸替代(Y440H)；菌株B4、B5的靶酶基因cyp51B編碼區(qū)有G1587T的點突變,導致14α脫甲基酶第441位的甘氨酸被纈氨酸替代(G441V)；菌株A1的靶酶基因cyp51B編碼區(qū)有T1618C的點突變,但14α脫甲基酶沒有氨基酸的替換；菌株A3的靶酶基因cyp51B編碼區(qū)有G1587A、T1618C的點突變,導致14a脫甲基酶第441位的甘氨酸被天冬氨酸替代(G441D)；菌株C3、B3的靶酶基因cyp51B編碼區(qū)未見點突變。(7)PMFLC耐藥株與標準株FRR2161比較,藥物排出泵基因AtrF、Mdr1、 PMFCZ表達量增高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；而靶酶基因cyp51B、藥物排出泵基因ABC和MFS表達量差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論體外誘導PMFLC耐藥株成功,并且該FLC耐藥特性可穩(wěn)定傳代；唑類藥物靶酶基因cyp51B的點突變可能是PM出現(xiàn)FLC耐藥現(xiàn)象的主要原因；部分藥物排出泵基因表達水平的上升可能也參與到了FLC耐藥機制中。
[Abstract]:In this study , we studied the relationship between the drug resistance and the expression and function of the drug efflux pump . 瑙傚療25鈩冩椂瀹為獙鑿屾牚鐨勪駭瀛㈢粨鏋勶紱(4)鎻愬彇鏍囧噯鏍強FLC鑰愯嵂鏍殑DNA,嫻嬪畾瀹為獙鑿屾牚鐨処TS (Internal Transcribed Spacer)鍖哄簭鍒，

本文編號：1417551