本文關(guān)鍵詞：一種新型基因轉(zhuǎn)換系統(tǒng)檢測基因早期突變方法的建立與驗(yàn)證　出處：《蘇州大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 高保真DNA聚合酶 限制性內(nèi)切酶 體外基因轉(zhuǎn)換開關(guān) CDH1

【摘要】：目的:建立一種偶聯(lián)高保真DNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶構(gòu)成的體外基因型轉(zhuǎn)換系統(tǒng),采用CDH1基因c.67CT突變作為測試體系,驗(yàn)證此基因轉(zhuǎn)換系統(tǒng)方法的可行性。方法:首先構(gòu)建含有HaeIII酶切位點(diǎn)的CDH1基因野生型片段模板和突變序列模板。將CDH1基因野生型基因片段與突變型基因片段按照野生比突變(W:T)=10:1,100:1,1000:1的比例混合,模擬人類早期腫瘤時(shí)血中游離核酸中突變基因較少而野生型基因片段較多的臨床情形。使用高保真DNA聚合酶在有HaeIII酶存在的情況下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使野生型基因序列片段由于HaeIII酶存在而不停地在體外基因型轉(zhuǎn)換的每個循環(huán)中均被限制性內(nèi)切酶消化,擴(kuò)增效率降低;而突變型基因序列片段由于突變位點(diǎn)正好位于酶切位點(diǎn),不能被HaeIII酶酶切消化,從而可以被大量擴(kuò)增;同時(shí),高保真DNA聚合酶還能對限制性內(nèi)切酶消化的野生片段進(jìn)行校正,將其在突變點(diǎn)相對應(yīng)的野生堿基切除,然后依據(jù)突變序列為模板進(jìn)行擴(kuò)增,達(dá)到了基因型轉(zhuǎn)換的效果。結(jié)果:3種不同比例的野生和突變序列混合PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,在高保真DNA聚合酶介導(dǎo)的PCR反應(yīng)偶聯(lián)限制性內(nèi)切酶所構(gòu)成的體外基因型轉(zhuǎn)換體系中,純野生型基因片段的PCR產(chǎn)物可以被HaeIII限制性內(nèi)切酶酶切,而存在突變型基因片段的PCR產(chǎn)物的則有不能被酶切的片段產(chǎn)生,這是一種很好的二元化顯示效果。測序結(jié)果也證實(shí)了突變型基因獲得了大量擴(kuò)增,其中10:1的結(jié)果完全翻轉(zhuǎn),由10:1變成了大約2:3。由此可以驗(yàn)證基因型轉(zhuǎn)換系統(tǒng)是一種具有特異性和靈敏度的新的檢測方法。結(jié)論:本課題在充分利用高保真DNA聚合酶及耐高溫的限制性內(nèi)切酶特點(diǎn)的基礎(chǔ)上聯(lián)合特異性引物構(gòu)成一個基因轉(zhuǎn)換系統(tǒng),通過采用CDH1基因c.67CT單個堿基突變作為測試對象,驗(yàn)證了新方法的可行性。這個基因轉(zhuǎn)換系統(tǒng)可在基因早期篩查以及腫瘤手術(shù)后的復(fù)發(fā)監(jiān)控等多方面具有較大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R440

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