本文關(guān)鍵詞：融合蛋白CTP-FoxM1對(duì)小鼠骨髓來(lái)源樹突狀細(xì)胞免疫活化作用的初步研究　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的：初步探討融合蛋白CTP-FoxM1對(duì)小鼠骨髓來(lái)源DCs的免疫活化作用,為探索其是否能夠在體內(nèi)發(fā)揮免疫效應(yīng)奠定基礎(chǔ)。方法：(1)無(wú)菌條件下分離小鼠骨髓來(lái)源的細(xì)胞,紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后,GM-CSF聯(lián)合IL-4體外誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞至第7d,光鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài),流式細(xì)胞術(shù)分析檢測(cè)細(xì)胞表面分子CD40、CD80、CD86及MHC-Ⅱ的表達(dá)情況,ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12的釋放水平,MLR檢測(cè)細(xì)胞刺激同種異體淋巴細(xì)胞的能力。(2)融合蛋白CTP-FoxM1、CTP、FoxM1分別作用DCs 48h后,CCK-8試劑盒檢測(cè)其存活率,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面分子表達(dá)情況,ELISA法檢測(cè)其培養(yǎng)上清中IL-12的分泌水平。(3)DCs經(jīng)融合蛋白CTP-FoxM1、CTP、FoxM1作用48h后,與小鼠脾臟來(lái)源的CD8+T細(xì)胞共同培養(yǎng)72h, ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中IFN-γ、TNF-α的分泌情況。結(jié)果：(1)從每只小鼠的骨髓可獲得約3×107個(gè)細(xì)胞,光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞伸出“樹枝狀”突起,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè),細(xì)胞表面標(biāo)志性分子CD11c表達(dá)量為88±4.66%,與未經(jīng)LPS刺激的細(xì)胞相比,經(jīng)LPS刺激的細(xì)胞表面分子表達(dá)量明顯增高(P0.001),其培養(yǎng)上清中的IL-12水平增高(P0.001)。結(jié)果表明通過(guò)該方法成功獲得較高純度的DCs。MLR實(shí)驗(yàn)顯示經(jīng)DCs作用后的T細(xì)胞其增殖率明顯較未經(jīng)DCs作用的T細(xì)胞高(P0.01),表明經(jīng)該方法分離誘導(dǎo)培養(yǎng)的DCs具有較強(qiáng)的刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力。(2) CTP-FoxM1對(duì)DCs的存活有抑制作用,且在一定范圍內(nèi)與濃度呈正相關(guān)。與蛋白CTP、FoxM1相比,CTP-FoxM1可明顯上調(diào)DCs表面分子CD40、CD80、CD86及MHC-Ⅱ的表達(dá)量(P0.001),促進(jìn)DCs培養(yǎng)上清中IL-12的分泌(P0.001)。(3)將融合蛋白CTP-FoxM1、CTP、FoxM1抗原負(fù)載的DCs與CD8+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),CTP-FoxM1組上清液中細(xì)胞因子IFN-γ、 TNF-α的分泌量較CTP組(P0.001,P0.001)和FoxM1組高(P0.001,P0.01)。結(jié)論：(1)經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室改進(jìn),紅細(xì)胞裂解法能夠分離出純度較高的DCs,可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)；(2)融合蛋白CTP-FoxM1能夠上調(diào)DCs表面分子表達(dá),誘導(dǎo)IL-12分泌,具有免疫活化DCs的潛能。(3) CTP-FoxM1作用后的DCs與CD8+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后,其上清IFN-γ、TNF-α分泌水平顯著上調(diào),提示CTP-FoxM1可能具有誘導(dǎo)DCs發(fā)揮抗原交叉遞呈功能,介導(dǎo)CD8+T淋巴細(xì)胞發(fā)揮CTL免疫應(yīng)答的潛能。
[Abstract]:Objective: to preliminarily explore the immune activation effect of fusion protein CTP-FoxM1 on mouse bone marrow derived DCs, and lay a foundation for exploring whether it can play an immune role in vivo. Methods: (1) isolated from mouse bone marrow cells under aseptic conditions, red blood cell lysis of red blood cells, cultured cells to the 7d GM-CSF and IL-4 in vitro, the cell morphology was observed under the light microscope, the expression analysis of cell surface marker CD40 and CD80, CD86 and MHC- with flow cytometry. The release level of supernatant of IL-12 cells was detected by ELISA MLR detection of cell culture, the ability to stimulate allogeneic lymphocytes. (2) after fusion protein CTP-FoxM1, CTP and FoxM1 acted on DCs 48h respectively, the survival rate of CCK-8 was detected by CCK-8 kit. The expression of surface molecules was detected by flow cytometry. The secretion level of IL-12 in the culture supernatant was detected by ELISA. (3) after DCs was treated with fusion protein CTP-FoxM1, CTP and FoxM1 for 48h, 72h was co cultured with mouse spleen derived CD8+T cells, and ELISA kit was used to detect the secretion of IFN- gamma and TNF- alpha in the supernatant. Results: (1) from each mouse bone marrow can be approximately 3 x 107 cells under light microscope, cells extended dendritic protrusions by flow cytometry, cell surface markers of CD11c expression was 88 + 4.66%, compared with the untreated LPS cells stimulated by cell surface molecular stimulation of LPS expression were increased (P0.001), the culture supernatant of elevated levels of IL-12 (P0.001). The results show that the high purity DCs is successfully obtained by this method. MLR test showed that the proliferation rate of T cells after DCs treatment was significantly higher than that of T cells without DCs (P0.01), indicating that the isolation and culture of DCs induced by this method had strong ability to stimulate T lymphocyte proliferation. (2) CTP-FoxM1 has a inhibitory effect on the survival of DCs, and has a positive correlation with the concentration in a certain range. Compared with protein CTP and FoxM1, CTP-FoxM1 significantly increased the expression of DCs surface molecules CD40, CD80, CD86 and MHC- II (P0.001), and promoted the secretion of IL-12 in DCs culture supernatant (P0.001). (3) co culture of DCs loaded with fusion protein CTP-FoxM1, CTP and FoxM1 antigen and CD8+T lymphocytes. The secretion of cytokine IFN- IFN- and TNF- alpha in CTP-FoxM1 group supernatant was higher than that in CTP group (P0.001, P0.001) and CTP group. Conclusion: (1) through the improvement of our laboratory, the red cell lysis method can isolate DCs with high purity, which can meet the following experiments. (2) fusion protein CTP-FoxM1 can upregulate the expression of DCs surface molecules and induce IL-12 secretion, and has the potential to activate DCs by immunization. (3) after the co culture of DCs and CD8+T lymphocytes after CTP-FoxM1, the level of IFN- gamma and TNF- alpha secretion was significantly up-regulated, suggesting that CTP-FoxM1 may have the potential to induce DCs to play the function of antigen cross delivery, and mediate CD8+T lymphocytes to play the potential of CTL immune response.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R446.6

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