本文關(guān)鍵詞： 標(biāo)準(zhǔn)湯劑 單分子測序 全程質(zhì)控 新型飲片 質(zhì)量追溯 中藥復(fù)方 組合全長條形碼　出處：《北京中醫(yī)藥大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：中藥品質(zhì)是決定其臨床療效的關(guān)鍵,對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制是臨床應(yīng)用的前提。在傳統(tǒng)中醫(yī)藥為全世界做出更大貢獻(xiàn)的同時(shí),一些質(zhì)量問題仍在影響其健康發(fā)展。例如中成藥摻假、夾雜及含有受保護(hù)動(dòng)物制品,飲片形式多種多樣而無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),中藥材質(zhì)量參差不齊等。針對(duì)以上問題,我們從生產(chǎn)實(shí)際出發(fā),期望通過相關(guān)環(huán)節(jié)質(zhì)量控制技術(shù)創(chuàng)新以保證中藥品質(zhì),并通過質(zhì)量追溯在整體產(chǎn)業(yè)鏈水平構(gòu)建品質(zhì)評(píng)價(jià)體系,促進(jìn)各環(huán)節(jié)的工藝優(yōu)化和質(zhì)量控制,保障中藥產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定和療效可靠。1.中藥復(fù)方組合全長條形碼DNA鑒定研究中成藥中的摻假、夾雜,不僅影響臨床用藥的安全性和有效性,同時(shí)因涉及受保護(hù)動(dòng)物而存在監(jiān)管難題。目前復(fù)方鑒定以分子鑒定較準(zhǔn)確,其中以依據(jù)DNA條形碼測序進(jìn)行鑒定通用性強(qiáng),但挑克隆一代測序通量低,二代測序讀長較短,而長讀長、高通量第三代測序技術(shù)有望彌補(bǔ)這些不足。通過三代單分子測序,經(jīng)CCS(Circular Consensus Sequence,環(huán)形測序保守序列)處理提高結(jié)果Reads質(zhì)量和準(zhǔn)確度,獲得全長條形碼DNA序列,并使用條形碼組合提高鑒定準(zhǔn)確性和檢出概率。樣品經(jīng)DNA提取,標(biāo)簽引物PCR擴(kuò)增,磁珠純化制備建庫樣本,并上機(jī)測序;下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)CCS處理,數(shù)據(jù)抽取獲得結(jié)果Reads,最后聚類、校驗(yàn)和物種鑒定。以生脈散(由人參、麥冬、五味子構(gòu)成,比例3:3:2)為例,分別制備散劑、各單味藥DNA樣本及由單味藥DNA混合的DNA樣本(混DNA),各DNA樣本分別制備ITS2序列和psbA-trnH序列建庫樣本進(jìn)行三代測序并進(jìn)行鑒定分析;并采用ITS2和CO1序列對(duì)含動(dòng)物藥的三味蒺藜散(蒺藜,冬葵果,方海)進(jìn)行鑒定,作為方法驗(yàn)證。同時(shí),通過生脈散ITS2序列挑克隆一代測序進(jìn)行方法比較分析。結(jié)果從生脈散ITS2序列PCR產(chǎn)物中挑取了 81個(gè)克隆,其中76個(gè)鑒定為人參,5個(gè)鑒定為五味子,未檢出麥冬。三代測序樣本中,除麥冬的ITS2序列建庫樣本因擴(kuò)增困難有較多外源序列外,其它樣本與預(yù)期一致。生脈散ITS2序列建庫樣本中能檢出人參和五味子,psbA-trnH序列建庫樣本中能檢出五味子、麥冬和人參屬(Panax sp.)的序列。以其中一份生脈散(SRD-i15/T15)為例,得到890條ITS2結(jié)果Reads,其中840條為人參,50條為五味子;得到4443條psbA-trnH結(jié)果Reads,其中人參屬3429條,五味子986條,麥冬28條。三味蒺藜散中各藥味組成都得到鑒定,并檢出了 5種外源植物(包括槐Sophora japonica,牛膝Achyranthes bidentata,豇豆 Vignaunguiculata,甘草 Glycyrrhiza uralensis,甘藍(lán) Brassica oleracea)、2 種外源動(dòng)物(卷蛾科 Tortricidae sp.,印度谷螟Plodia interpunctella)及 2種微生物的序列,且外源序列Reads數(shù)和種類數(shù)隨測序深度增加而呈現(xiàn)上升趨勢。兩種散劑共10個(gè)混DNA建庫樣本結(jié)果Reads中均無外源物種序列,散劑建庫樣本中檢出的外源物種來源于散劑自身,推斷是由于原料不夠純凈引入的。三代測序結(jié)果Reads總有效率99.93%,大部分樣本(39/46)有效率達(dá)100%,幾乎沒有無法解釋的結(jié)果Reads,平行樣本間結(jié)果相近,表明該方法穩(wěn)定可行;即使是原料夾帶的外源動(dòng)植物都能在成藥中檢出并準(zhǔn)確鑒定,且能區(qū)分浙麥冬與川麥冬,及與西洋參ITS2序列極相近的人參序列,表明該方法檢出限極低、鑒定準(zhǔn)確。全長條形碼組合的交互驗(yàn)證、互補(bǔ)使鑒定更準(zhǔn)確,檢出概率更高,選用合適的條形碼能拓展用于其它領(lǐng)域的生物檢測鑒定。與現(xiàn)有中藥復(fù)方分子鑒定方法相比,組合全長條形碼策略通量較高,流程簡單、可批量處理,鑒定更準(zhǔn)確,結(jié)果更可信。2.中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究中藥新型飲片為臨床應(yīng)用提供便利的同時(shí)也存在質(zhì)量控制難題,包括鑒別困難、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、當(dāng)量混亂等。參考臨床應(yīng)用湯劑制備方法,兼顧質(zhì)量控制,以標(biāo)準(zhǔn)化為目的的中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究,有望為不同形式飲片的鑒別和質(zhì)量控制提供參考。另外,參照此策略進(jìn)行中藥復(fù)方、中藥藥對(duì)規(guī)范化研究,能為經(jīng)典名方、配伍理論等研究提供數(shù)據(jù)支撐。取符合藥典規(guī)定,產(chǎn)地、規(guī)格等級(jí)不同的12批次人參飲片,經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)工藝制備湯劑,從HPLC指紋圖譜相似度、出膏率、指標(biāo)成分含量及轉(zhuǎn)移率等方面對(duì)標(biāo)準(zhǔn)湯劑相關(guān)參數(shù)閾值及質(zhì)量影響因素進(jìn)行探討,制定準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn),并考察飲片經(jīng)湯劑制成顆粒過程中的質(zhì)量傳遞規(guī)律。結(jié)果12批次人參飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率范圍為40.5%～58.8%(為47.2%±5.6%,下同),人參皂苷Rg1+Re和Rb1的轉(zhuǎn)移率分別為57.5%～88.5%(76.0%±9.2%),68.7%～94.8%(80.3%±9.1%),批次間指紋譜圖相似度為 0.905～0.997(0.970±0.022),與對(duì)照指紋圖譜相似度為0.966～0.996(0.986±0.009);。人參飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)可設(shè)定為:Rg1+Re和Rb1的濃度應(yīng)分別不低于0.529,0.282 g·L-1，，出膏率應(yīng)不低于40.5%,批次間指紋圖譜相似度應(yīng)不低于0.905,與對(duì)照指紋圖譜相比應(yīng)不低于0.966。人參皂苷Rg1+Re每當(dāng)量含量可用于人參干膏粉、顆粒等質(zhì)量控制。標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量的主要影響因素是藥材品質(zhì),其中基原和產(chǎn)地是關(guān)鍵。由飲片制得湯劑是質(zhì)的轉(zhuǎn)移過程,而由湯劑制得顆粒是量變過程,表明標(biāo)準(zhǔn)湯劑(及其煎膏或干膏粉)可作為配方顆粒生產(chǎn)過程中的中間體參照物,以調(diào)整投料方案、優(yōu)化工藝設(shè)計(jì),保證與傳統(tǒng)飲片煎液質(zhì)量一致、穩(wěn)定終產(chǎn)品的生產(chǎn)。鑒于不同形式飲片臨床應(yīng)用多以水溶(煎煮或沖服)為主,與其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)一致的標(biāo)準(zhǔn)湯劑可作為標(biāo)準(zhǔn)參照物,解決鑒別和質(zhì)量控制難題。3.中藥材質(zhì)量控制體系探討全長條形碼鑒定對(duì)種質(zhì)不同的浙、川麥冬psbA-trnH序列差異位點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證;人參飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究表明藥材質(zhì)量與產(chǎn)地關(guān)系密切,而農(nóng)殘超標(biāo)、炮制不當(dāng)更是關(guān)系到中藥的安全性和臨床療效。鑒于中藥材質(zhì)量影響因素較多,需以質(zhì)量追溯體系為框架、結(jié)合環(huán)節(jié)質(zhì)控,構(gòu)建中藥材質(zhì)量控制體系。對(duì)現(xiàn)階段中藥材質(zhì)量追溯體系所面臨的問題與挑戰(zhàn)進(jìn)行分析,并提出解決方案,同時(shí)結(jié)合品質(zhì)生態(tài)學(xué)和產(chǎn)地區(qū)劃研究,以期從產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)和技術(shù)環(huán)節(jié)上共同為中藥材質(zhì)量控制體系發(fā)展獻(xiàn)策。分析表明,中藥材質(zhì)量追溯體系完善亟需發(fā)展集約化生產(chǎn),并適當(dāng)精簡產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu),建設(shè)配套倉儲(chǔ)、物流設(shè)施。以五味子為例,結(jié)合其品質(zhì)影響因素和產(chǎn)地生態(tài)因子分析,采用藥用植物全球產(chǎn)地生態(tài)適宜性區(qū)劃信息系統(tǒng)(GMPGIS)進(jìn)行產(chǎn)地適宜性區(qū)劃,為不同適宜性區(qū)域類型的五味子種植選地和生產(chǎn)集約化提供參考,并提出五味子生產(chǎn)質(zhì)量控制體系框架。4.總結(jié)組合全長條形碼DNA鑒定提供了中藥復(fù)方生物組成全面、準(zhǔn)確鑒定的新方法,有利于中成藥質(zhì)量控制及動(dòng)物保護(hù);飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑可作為中間體參照物用于配方顆粒等新型飲片的生產(chǎn)質(zhì)控,為中藥飲片質(zhì)量控制提供新思路;中藥材品質(zhì)生態(tài)學(xué)和產(chǎn)地區(qū)劃研究保障正品藥材供應(yīng),促進(jìn)生產(chǎn)集約化和質(zhì)量追溯體系發(fā)展。這些技術(shù)方法用于中藥材、飲片、中成藥等產(chǎn)業(yè)鏈不同階段質(zhì)量控制,并通過質(zhì)量追溯形成完整的信息鏈條,結(jié)合終產(chǎn)品品質(zhì)評(píng)價(jià),促進(jìn)質(zhì)量形式轉(zhuǎn)變過程(種植、采收、加工、炮制、制劑等)的工藝改進(jìn)和質(zhì)量設(shè)計(jì),形成高科技水平的中藥全程質(zhì)量控制體系。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R28

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