本文關(guān)鍵詞：基于量子點(diǎn)的熒光生物與化學(xué)傳感器及其食品安全快速檢測應(yīng)用　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：食品安全是全球公共性衛(wèi)生安全問題,直接關(guān)系民生。近年來,食品安全惡性事件頻發(fā),食品安全問題逐漸成為社會(huì)焦點(diǎn)。在全球范圍內(nèi),由食品安全引起的問題和疾病,不僅造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,而且極大地危害了人們的生活健康水平,因此研究食品安全快速、準(zhǔn)確的檢測方法,以預(yù)防和控制危害事件的發(fā)生,具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和社會(huì)價(jià)值。生物與化學(xué)傳感器,是一個(gè)活躍的科學(xué)研究和工程技術(shù)領(lǐng)域,它共享生物學(xué)、化學(xué)、免疫學(xué)、物理學(xué)、電子學(xué)、材料學(xué)、信息學(xué)、以及微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)等學(xué)科,處在生命科學(xué)和信息科學(xué)的交叉區(qū)域。生物與化學(xué)傳感器具有高選擇性、高準(zhǔn)確性、分析快捷、操作簡單等優(yōu)點(diǎn),是一種先進(jìn)的檢測技術(shù)與方法。作為常用的光學(xué)檢測手段之一,熒光檢測靈敏、快速、便捷,檢測儀器設(shè)備成熟,已被廣泛應(yīng)用于各類檢測方法和儀器設(shè)備的科研開發(fā)中。納米材料發(fā)展于20世紀(jì)80年代,具有獨(dú)特的物理化學(xué)特性與廣闊的應(yīng)用前景,因而享有廣泛美譽(yù)。納米技術(shù)與材料應(yīng)用于生物傳感器的研發(fā),將帶來新的發(fā)展契機(jī),創(chuàng)造更為廣闊的應(yīng)用空間。量子點(diǎn)(Quantum Dots, QDs)是一種新興的納米發(fā)光材料,常作為熒光標(biāo)記物被廣泛用于生物傳感和細(xì)胞成像；同時(shí)它又是一種半導(dǎo)體的納米晶粒,由于其具有獨(dú)特的性質(zhì),比如尺寸可調(diào)、光學(xué)信號強(qiáng)、熒光量子產(chǎn)率高、光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等,近年來在生物傳感領(lǐng)域備受青睞。本論文將納米技術(shù)與光學(xué)檢測傳感技術(shù)相結(jié)合,開發(fā)新型的生物／化學(xué)傳感器,綜合運(yùn)用各學(xué)科不斷進(jìn)步的技術(shù)優(yōu)勢以提升其性能,并應(yīng)用于食品安全快速檢測領(lǐng)域。本文主要研究內(nèi)容、結(jié)果和結(jié)論如下：(1)用于快速檢測食用油摻假的功能化水溶性量子點(diǎn)熒光淬滅傳感器針對劣質(zhì)食用油摻假問題,特開展利用納米生化傳感檢測的方法,對其進(jìn)行快速鑒別。選用量子點(diǎn)作為納米熒光探針,當(dāng)加入被測物一“地溝油”勾兌的劣質(zhì)食用油時(shí),被測物中某些成分如重金屬離子、有機(jī)小分子、碳碳共軛雙鍵(C=C)、吸電子基團(tuán)、自由基等(淬滅劑)可以淬滅量子點(diǎn)的熒光。不同摻雜比例的劣質(zhì)食用油中含有不同濃度的淬滅劑,從而引起不同程度的熒光淬滅,宏觀上表現(xiàn)出不同的熒光強(qiáng)度,由此建立淬滅率與劣質(zhì)食用油中“地溝油”摻雜比例之間的定量關(guān)系。模擬人工勾兌方法,將毛“地溝油”以0.4、2、6、10%的比例摻入某合格食用植物油中,配制成不同摻雜比例的劣質(zhì)食用油,然后用量子點(diǎn)熒光淬滅法鑒別劣質(zhì)食用油。結(jié)果發(fā)現(xiàn)劣質(zhì)食用油對量子點(diǎn)熒光的淬滅率隨著其摻雜濃度的增加而增大。將不同劣質(zhì)食用油對量子點(diǎn)熒光的淬滅率與摻雜比例作圖,可以發(fā)現(xiàn)兩者之間呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系(y=5.96x+14.99；R2=0.94)。因此,該基于功能化水溶性量子點(diǎn)熒光淬滅傳感器可在2 min內(nèi)對摻假0.4%及以上的劣質(zhì)食用油進(jìn)行快速鑒別,具有很大的現(xiàn)場應(yīng)用前景。(2) 用于于-快速檢測禽流感病毒的基于于-DNA智能響應(yīng)水凝膠的熒光適配體傳感器建立了一種基于智能響應(yīng)水凝膠的快速檢測禽流感病毒H5N1的熒光適配體傳感器。選擇對禽流感病毒H5N1具有高親和力的DNA核酸適配體作為生物識別元件,通過對其5’末端修飾丙烯酰胺基(Acrydite),對其3’末端修飾修飾熒光淬滅基團(tuán)Iowa Black(?) RQ,進(jìn)行功能化修飾；針對性設(shè)計(jì)可與核酸適配體序列互補(bǔ)的單鏈DNA1和單鏈DNA2,并在單鏈DNA1的5’末端修飾丙烯酰胺基,在單鏈DNA2的5’末端修飾熒光量子點(diǎn)；丙烯酰胺基修飾的DNA鏈在引發(fā)劑的催化下能夠聚合形成含有多條DNA支鏈的聚丙烯酰胺鏈；核酸適配體與單鏈DNA1之間的堿基互補(bǔ)配對發(fā)揮了交聯(lián)劑的作用,使兩種聚合物鏈相互連接,從而形成水凝膠；當(dāng)不存在目標(biāo)病毒時(shí),由于DNA鏈之間的雜交作用,凝膠處于收縮狀態(tài),量子點(diǎn)由于距離淬滅劑很近其熒光被淬滅；而當(dāng)存在目標(biāo)病毒時(shí),適配體與目標(biāo)病毒的結(jié)合導(dǎo)致DNA鏈之間的雜交被分解,使得凝膠溶脹,造成量子點(diǎn)與淬滅劑之間的距離增大,從而量子點(diǎn)熒光被恢復(fù)。結(jié)果表明該熒光適配體傳感器的檢測時(shí)間小于30min,最低檢測限為0.2 HAU,線性范圍為2-2.3 to 26 HAU/20μL-1。因此,所研究的簡便、廉價(jià)、高特異性的適配體傳感器在現(xiàn)場快速檢測禽流感病毒H5N1中具有較大的應(yīng)用前景。(3)用-于-同時(shí)檢測四種食源性致病菌的結(jié)合免疫納米磁分離的熒光生物傳感器及便攜式熒光生化快速檢測儀的現(xiàn)場應(yīng)用在食源性致病菌的檢測中,同時(shí)檢測多元細(xì)菌具有很大的需求和發(fā)展?jié)摿�。本課題結(jié)合免疫納米磁分離技術(shù)作為樣品分離和富集手段,利用納米熒光量子點(diǎn)作為熒光信號報(bào)告分子,研究了一種快速、專一的可同時(shí)分離和定量檢測大腸桿菌O157：H7、單增李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等四種食源性致病菌的熒光適配體傳感器。本文采用可查文獻(xiàn)中粒徑最小(25 nm)的納米磁珠,其分別交聯(lián)四種特異性抗體后可在45 min內(nèi)從復(fù)雜食品基質(zhì)中同時(shí)捕獲四種目標(biāo)細(xì)菌,并在磁場作用下實(shí)現(xiàn)同時(shí)分離。將四種不同的鏈霉親合素修飾的量子點(diǎn)分別交聯(lián)上生物素化的特異性核酸適配體,用于對目標(biāo)細(xì)菌的熒光標(biāo)記。通過便攜式熒光光譜儀讀取熒光信號,從不同的熒光發(fā)射波長可以定性地判斷不同的目標(biāo)細(xì)菌,而從熒光強(qiáng)度則可定量反應(yīng)多種目標(biāo)細(xì)菌的濃度,從而實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測。掃描電子顯微鏡和熒光共聚焦顯微鏡用于表征免疫磁珠捕獲到的細(xì)菌和“磁珠-細(xì)菌-量子點(diǎn)”的“三明治”結(jié)構(gòu)。通過有限元分析,模擬了磁場的特性,并建立了免疫磁珠捕獲細(xì)菌進(jìn)行磁分離的數(shù)學(xué)模型。結(jié)果表明,對大腸桿菌0157：H7、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌的磁分離效率分別達(dá)到90.4%、87.5%、92.0%和92.0%,在純培養(yǎng)物中的方法檢測限分別達(dá)到80、100、47和160 CFU/mL,在牛肉樣品中的方法檢測限為320、350、110和750 CFU/mL。本文研究的適配體熒光傳感器能夠在2.5 h內(nèi)對10’至104 CFU/mL的四種食源性致病菌進(jìn)行同時(shí)分離富集和定量檢測,展示了該技術(shù)在致病微生物多元檢測現(xiàn)場應(yīng)用中的極大潛力。另外,針對沙門氏菌、大腸桿菌、李斯特菌等常見食源性致病菌,選取具有高度特異性和靈敏度的抗體制備生物傳感材料,結(jié)合免疫納米磁分離技術(shù),利用所研究的可同時(shí)快速分離和檢測多元食源性致病菌的熒光生物傳感方法,對食品中常見的致病菌進(jìn)行檢測,驗(yàn)證了合作單位研制的病原菌檢測用便攜式熒光生物傳感檢測儀器的可行性。納米磁珠分別交聯(lián)三種特異性抗體后可同時(shí)捕獲目標(biāo)細(xì)菌,在磁場作用下實(shí)現(xiàn)同時(shí)分離。將分離物分別標(biāo)記上三種偶聯(lián)有抗體的熒光量子點(diǎn),即可進(jìn)行熒光信號的讀取,從而實(shí)現(xiàn)了對多種目標(biāo)細(xì)菌的同時(shí)快速檢測。采用該儀器檢測,總檢測時(shí)間(定義為取樣前期處理一直到測定結(jié)果讀出的時(shí)間總和)少于60 min。應(yīng)用此技術(shù),可實(shí)現(xiàn)肉品、蔬菜、水產(chǎn)品等食品在物流與銷售過程中的現(xiàn)場、在線監(jiān)測和快速預(yù)警,將有效避免致病菌感染等危險(xiǎn)食品安全事件的發(fā)生,有效提高食品安全水平。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：TS201.6;O657.3
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本文編號：1393477