口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus,FMDV）分為7個血清型:A、O、C、Asia l、SAT1、2、3。其中,南非型（Southern Africa Territories,SAT）口蹄疫具有明顯的地域性,主要集中在撒哈拉沙漠以南,侵害水牛及其他偶蹄動物。近幾年的報告表明,中東地區(qū)暴發(fā)了南非2型口蹄疫（SAT2 FMD）,跨越了長久以來的地域界限,存在進(jìn)入我國的風(fēng)險,給我國的養(yǎng)殖業(yè)造成了潛在的威脅。我國在SAT2 FMDV方面的研究較少,了解其蛋白結(jié)構(gòu)與抗原表位對研制儲備疫苗具有重要意義。本研究參考相關(guān)文獻(xiàn),選擇了SAT2 FMDV（PAT/1/2012,GenBank:JX014256）結(jié)構(gòu)蛋白VP1上編碼的B細(xì)胞表位（VYTKAAAAIRGDRAALAAKYADTNHTLPPTFNF GYVTVDK）和T細(xì)胞表位（NVQEGRRKHTDVAFLLDRST）,為設(shè)計SAT2 FMDV表位疫苗奠定了基礎(chǔ)。豬細(xì)小病毒（Porcine Parvovirus,PPV）能導(dǎo)致初產(chǎn)母豬及血清學(xué)陰性的經(jīng)產(chǎn)母豬發(fā)生流產(chǎn)、不孕、產(chǎn)死胎、木乃伊胎及弱仔等。在豬群里的檢... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

口蹄疫區(qū)域病毒池(OIE/FAO,2018a)

肍MD在一些國家和地區(qū)已經(jīng)被慢慢控制或消滅，控制FMD在全世界范圍內(nèi)取得了很大成果。截至2018年底，OIE182個成員國中，被確認(rèn)為非免疫無FMD：68個國家；被確認(rèn)為免疫無FMD：巴拉圭和烏拉圭；被確認(rèn)為非免疫無FMD地區(qū)：阿根廷等11個國家；免疫無FMD地區(qū)：土耳其等8個國家的部分地區(qū)(FAOetal.,2019)（圖1-2）。蒙古、中國和納米比亞的FMD法定防控方法受到OIE認(rèn)可(OIE,2018a)。世界范圍內(nèi)FMD防控雖然得到了令人肯定的結(jié)果，但是亞洲和非洲的FMD情況較為慘重，一些國家和地區(qū)多年未見FMD再次暴發(fā)，全球口蹄疫防控仍然道阻且長。圖1-2OIE認(rèn)可為無FMD國家/地區(qū)分布(OIE/FAO,2019)Fig.1-2Distributionofcountries/regionswithoutFMDrecognizedbyOIE中國的防控措施以免疫為主，O、A、Asia1型FMD強制免疫，目前得到了顯著成效。根據(jù)我國農(nóng)業(yè)部第2635號公告(中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部，2018)，發(fā)現(xiàn)Asia1型FMD防控措施為強制銷毀。統(tǒng)計分析2018年我國通報的FMD數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，總共12個�。ㄗ灾螀^(qū)）共上報27起FMD疫情(孫映雪等，2019)。主要感染動物為牛和豬，分別有16、10起，流行毒株包括O型毒株（O/ME-SA/PanAsia、O/ME-SA/Ind-2001、O/SEA/Mya-98、O/CATHAY）和A型毒株（A/ASIA/Sea-97）。在全球FMD防控策略和《國家口蹄疫防治計劃（2016-2020年）》(中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部，2016)的指導(dǎo)下，我國FMD疫情呈散發(fā)(孫映雪等，2019)。我國與疫情嚴(yán)重的西亞-中東、東南亞和南亞相鄰，近10年外來毒株高頻率傳入，現(xiàn)階段我國主要流行毒株均是跨境輸入，所以，我國應(yīng)該對境外毒株流行趨勢和傳播方向進(jìn)行隨時觀測(張永光，2019)。SAT2FMD尚未在中國發(fā)生，但是它已經(jīng)通過地理邊界（撒哈拉沙漠）侵入中東，與非洲頻繁的貿(mào)易也對我國的畜牧業(yè)和乳制品的發(fā)展構(gòu)成了威脅，目前存

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章PPVAV30的病毒純化及形態(tài)觀察112.2.3PPVAV30病毒純化（1）配制40%PEG6000溶液。（2）收集病毒上清液：10,000r/min離心25min。（3）沉淀病毒：將40%PEG6000溶液與細(xì)胞上清液混合（體積比為1:3），4℃緩慢攪拌12h后，10,000r/min離心60min。（4）PBS重懸病毒：用無菌1×PBS緩沖液重懸病毒沉淀。（5）17%蔗糖墊純化病毒：向超速離心管底加入4mL17%蔗糖溶液，將病毒液緩慢加入在其上層，30,000r/min超速離心4h。（6）用PBS緩沖液重懸，浸泡過夜后，5000r/min離心20min。（7）將上清分裝，-20℃保存待用。2.2.4電鏡觀察取純化的PPVAV30病毒10μL滴加到銅網(wǎng)中間，室溫下吸附15min后，使用吸水紙從側(cè)面吸去液體風(fēng)干。再取2%磷鎢酸鈉溶液10μL染色8min后，使用吸水紙從側(cè)面吸去液體風(fēng)干。將銅網(wǎng)放置于多孔板中準(zhǔn)備透射電鏡觀察。2.3實驗結(jié)果2.3.1PPVAV30引起PK-15細(xì)胞病變將過濾后的PPVAV30病毒液加入到PK-15細(xì)胞中培養(yǎng)，細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變：細(xì)胞變圓，聚集，病變細(xì)胞脫落，出現(xiàn)空斑，如圖2-1示。將病變細(xì)胞反復(fù)凍融3次，10000r/min離心20min，收集上清，-70℃凍存。圖2-1PPVAV30感染PK-15細(xì)胞病變情況（400×）Fig.2-1CytopathogeniceffectsofPK-15cellsinfectedwithPPVAV30(400×)（a）：正常培養(yǎng)24h后的PK-15細(xì)胞；（b）：PPVAV30感染24h后的PK-15細(xì)胞(a):NormalPK-15cellsafterculture24h;(b):PPVAV30InfectedPK-15cellsafter24h2.3.2病毒粒子電鏡觀察將實驗室凍存的PPVAV30細(xì)胞毒在流水下融化過濾后，接種到PK-15細(xì)胞上培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代，顯微鏡下觀察到明顯病變，有聚團(tuán)脫落現(xiàn)象。收集病毒上清純化后，用透射電鏡（Transmission

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]The DEAD-Box RNA Helicase DDX1 Interacts with the Viral Protein 3D and Inhibits Foot-and-Mouth Disease Virus Replication[J]. Qiao Xue,Huisheng Liu,Qiaoying Zeng,Haixue Zheng,Qinghong Xue,Xuepeng Cai.  Virologica Sinica. 2019(06)
[2]豬口蹄疫現(xiàn)狀與防控[J]. 張永光.  獸醫(yī)導(dǎo)刊. 2019(19)
[3]2018年全球口蹄疫流行狀況分析[J]. 孫映雪,朱琳,陳偉,王夢瑤,彭冬,張秀娟,鄭雪光,宋建德.  中國動物檢疫. 2019(06)
[4]豬細(xì)小病毒病毒樣顆粒的體外組裝[J]. 宋品,孫世琪,董虎,滕志東,曹隨忠,郭慧琛,余樹民.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2017(06)
[5]豬口蹄疫疫苗免疫效果臨床評價技術(shù)及應(yīng)用[J]. 呂建亮,張永光,楊漢春,童光志,姜平,何啟蓋,張桂紅,張改平,鐘土木,賴守勛.  中國畜牧雜志. 2015(20)
[6]豬細(xì)小病毒病毒樣顆粒疫苗研究進(jìn)展[J]. 劉運超,陳玉梅,姬鵬超,趙寶磊,王聚財,鄧瑞廣,張改平.  河南農(nóng)業(yè)科學(xué). 2015(10)
[7]全球口蹄疫流行和防控狀況[J]. 宋建德,袁麗萍,秦建國,朱迪國,劉陸世,孫洪濤,孫映雪,魏榮.  中國動物檢疫. 2015(08)
[8]2013年全球口蹄疫流行狀況[J]. 宋建德,朱迪國,袁麗萍,龐素芬,魏榮.  中國動物檢疫. 2014(06)
[9]病毒樣顆�？乖谋磉_(dá)、純化、組裝和鑒定[J]. 于永利.  微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展. 2014(01)
[10]N端嵌合口蹄疫病毒中和表位的豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白的表達(dá)及其免疫原性[J]. 李艷麗,曹軼梅,盧曾軍,孫普,李平花,白興文,付元芳,包慧芳,李冬,劉在新.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2013(09)

碩士論文
[1]嵌合口蹄疫病毒中和表位的豬細(xì)小病毒衣殼蛋白免疫原性研究[D]. 李文麗.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[2]展示口蹄疫病毒中和表位的豬細(xì)小病毒樣顆粒組裝[D]. 范朋舉.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2014
[3]嵌合口蹄疫病毒中和表位的豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白表達(dá)與免疫原性研究[D]. 李艷麗.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2013
[4]FMDV中和表位在HBc上的展示及其嵌合蛋白在重組腺病毒中的表達(dá)[D]. 姜志剛.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2010



本文編號：3092532