發(fā)布時間：2018-03-09 01:15

  本文選題：HRM　切入點：tHDA　出處：《華南理工大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：當(dāng)今食源性疾病已成為一個全球關(guān)注的食品衛(wèi)生問題,水產(chǎn)品、肉制品和奶制品等食物中經(jīng)常同時發(fā)現(xiàn)沙門氏菌(Salmonella)、單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等食源性致病菌,單獨檢測一種致病菌的方法已經(jīng)無法滿足現(xiàn)今社會對致病菌檢測的高效率要求。目前國內(nèi)常用的食源性致病菌檢測法——傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法存在操作繁瑣、檢測時間較長,靈敏度較低等不足。為建立一種同時檢測沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌三種致病菌的快速、簡便、高通量、低成本的檢測體系,本研究分別以invA、hly和Sa442基因為沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的靶基因,結(jié)合特異性引物,創(chuàng)新性地建立HRM-real time PCR和HRM-tHDA檢測體系。 (1)HRM-real time PCR體系。建立單重HRM-real time PCR體系,在其基礎(chǔ)上建立多重HRM-real time PCR體系,并對引物濃度、模板濃度、熔解速率等因素進行優(yōu)化,最終確定多重IRM-real time PCR體系(25μL)為：10×buffer2.5μL,Taq多聚酶(5U/μL)0.5μL,Taq多聚酶抗體(5U/μL)0.5μL,dNTP(10mmol/L)2.5μL,MgCl2(25mmol/L)3.0μL,上/下游引物(10μmol/L)0.5μL,模板DNA(0.5μmol/L)2.0μL,EvaGreen (20mg/mL)1.25μL,BSA(20mg/mL)0.2μL,去核酸水補齊至25μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性10min；95℃變性10s,60℃退火45s,40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物進行高分辨率熔解曲線分析,熔解程序為：95℃2min,60℃2min:60℃1s,然后升溫至95℃(熔解速率為0.2℃C/s),最后50℃冷卻。 對多重HRM-real time PCR體系進行特異性、敏感性及重復(fù)性評價,進而將該體系應(yīng)用在人工染菌樣本及自然染菌樣本的檢測中。特異性試驗表明,參與試驗的90株目標(biāo)菌株檢測結(jié)果均為陽性,沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的Tm值分別為79.4±0.14℃,82.5±0.15℃和77.4±0.14℃；44株非目標(biāo)菌株均為陰性,說明該體系具有較高的特異性。靈敏度試驗表明,該體系檢測沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌單一致病菌的靈敏度均為102CFU/mL；同時檢測三種目標(biāo)菌種的靈敏度為：102、102和103CFU/mL。穩(wěn)定性實驗結(jié)果為：該體系檢測三種目標(biāo)菌種的組內(nèi)變異系數(shù)(CV值)均低于2.17%,組間CV值均低于3.93%,提示該體系具有較高的穩(wěn)定性。對50份人工染菌樣本中三種目標(biāo)菌的檢測限均為5CFU/25g食品,相比國標(biāo)法具有較高的準(zhǔn)確性及靈敏度。對120份天然染菌豬肉樣本分別用HRM-real time PCR、測序法和國標(biāo)法三種方法檢測沙門氏菌,陽性檢出率分別為25.00%,25.00%和24.17%,相比國標(biāo)法具有較高的陽性檢出率；三種方法檢測單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的陽性檢出率則相同。 (2) HRM-tHDA體系。研發(fā)出簡便高效的Tte-uvrD粗酶蛋白制備法：以騰沖嗜熱厭氧菌基因組DNA為模板,克隆表達(dá)出Tte-uvrD,再經(jīng)超聲破碎、硫酸銨沉淀、透析除鹽、凍干、復(fù)溶于酶貯存液中得到粗酶液。粗酶液具有較高的tHDA檢測靈敏度和反應(yīng)穩(wěn)定性。 建立基于Tte-uvrD粗酶液的單重HRM-tHDA反應(yīng)體系,體系(50μL)為：Tte-UvrD粗酶液(160ng/μL)3.5μL,10×Annealing buffer Ⅱ5.0μL,dNTP Mixture(10mmol/L each)3.5μL,NaCl(500mmol/L)4.0μL, MgSO4(100mmol/L)2.0μL,上/下游引物(10μmol/L)1.0μL,模板DNA (105CFU/mL)2.0μL,20x EvaGreen0.5μL, ddH2O補齊至50.0μL反應(yīng)程序為：63℃5s,62℃55s,進行40個循環(huán)；熔解程序為：95℃2min,60℃2min；60℃1s,然后升溫至95℃(熔解速率為0.2℃/s),最后50℃冷卻。 對HRM-tHDA單重反應(yīng)體系進行特異性、靈敏度及穩(wěn)定性評估,進而將該體系應(yīng)用在人工染菌樣本及自然染菌樣本的檢測中。特異性實驗結(jié)果表明：在參與試驗的30株目標(biāo)菌株和30株非目標(biāo)菌株中,只有目標(biāo)檢測菌種檢測結(jié)果為陽性,非目標(biāo)菌種均為陰性,提示該體系具有較高的特異性。沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌目的擴增產(chǎn)物的Tm值分別為79.4±0.13℃,82.4±0.11℃和77.5±0.16℃。靈敏度實驗表明,該體系分別檢測三種目標(biāo)菌的最低檢出限均為102CFU/mL。重復(fù)性實驗表明,三種目標(biāo)菌實驗內(nèi)CV值均低于2.61%,實驗間CV值均低于2.97%,提示該體系具有較高的重復(fù)性。該體系對人工染菌樣品中三種目標(biāo)菌的單重檢測的靈敏度均能達(dá)到5CFU/25g。對50份市售豬肉樣本的檢測試驗結(jié)果表明：單重IRM-tHDA法可達(dá)到和國標(biāo)法相等的陽性檢出率。 本研究建立并優(yōu)化了HRM-real time PCR和HRM-tHDA兩種致病菌檢測體系,體系特異性好、靈敏度高、重復(fù)性好,能應(yīng)用于食品樣本的檢測,具有快速、簡便、成本低廉的優(yōu)點和較強的實際應(yīng)用價值,其中HRM-real time PCR體系已應(yīng)用于致病菌多重檢測中。新的檢測體系的建立,對于建立完善的食品安全保障體系,確保食品供應(yīng)鏈的安全,預(yù)防和控制食源性致病菌,保障人類健康具有重大的實際意義。
[Abstract]:The food borne diseases have become a global concern of food hygiene, aquatic products, meat and dairy products and other foods are often found Salmonella (Salmonella), List Rand (Listeria monocytogenes) Listeria and Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) and other food borne pathogens, a method of separate detection of pathogenic bacteria has been unable to meet the social requirements for pathogen detection efficiency. The common foodborne pathogen detection method has a complicated operation, the traditional bacterial culture method, the detection time is longer, the sensitivity is low. In order to establish a simultaneous detection of Salmonella, Listeria Lester bacteria and Staphylococcus aureus three kinds of pathogenic bacteria fast, convenient, high-throughput, low cost detection system, this study respectively by invA, hly and Sa442 genes for Salmonella, Listeria and Staphylococcus Dan Zengli The target gene of cocci, combined with specific primers, innovatively established the HRM-real time PCR and HRM-tHDA detection system.
(1)HRM-real time PCR浣撶郴.寤虹珛鍗曢噸HRM-real time PCR浣撶郴,鍦ㄥ叾鍩虹涓婂緩绔嬪閲岺RM-real time PCR浣撶郴,騫跺寮曠墿嫻撳害,妯℃澘嫻撳害,鐔旇В閫熺巼絳夊洜绱犺繘琛屼紭鍖，

本文編號：1586361