本文關(guān)鍵詞：新型雙歧桿菌細(xì)菌素bifidocin A的提純、特性及分子結(jié)構(gòu)研究

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【摘要】：細(xì)菌素作為一種天然生物防腐劑,無(wú)毒、無(wú)殘留、綠色安全,目前研究顯示乳酸菌是細(xì)菌素的巨大來(lái)源庫(kù),而關(guān)于人體腸道重要優(yōu)勢(shì)菌群雙歧桿菌所產(chǎn)細(xì)菌素的報(bào)道非常有限。本課題擬篩選得到一株有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)細(xì)菌素雙歧桿菌優(yōu)良菌株,優(yōu)化其產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵條件,建立快速有效的提取純化方法,并對(duì)其理化及生物學(xué)特性和分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行初探。所得主要研究結(jié)果與結(jié)論如下:(1)成功從母乳嬰兒源糞便樣品中分離出一株具有顯著抑菌作用的雙歧桿菌優(yōu)良菌株,經(jīng)鑒定其為動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis),命名為BB04,排除各種干擾因素后確定其所產(chǎn)抑菌物質(zhì)為細(xì)菌素,并將其命名為bifidocin A。(2)通過(guò)單因素及響應(yīng)面法優(yōu)化,得到雙歧桿菌代謝產(chǎn)細(xì)菌素bifidocin A的最佳條件為:發(fā)酵時(shí)間40.28(40.5)h,發(fā)酵溫度34.55(35)℃,發(fā)酵起始pH6.75。利用此條件發(fā)酵雙歧桿菌BB04,所產(chǎn)細(xì)菌素效價(jià)可達(dá)到787.3 AU/m L,是優(yōu)化前的1.3倍。(3)基于細(xì)菌素的陽(yáng)離子和疏水特性,建立了雙歧桿菌細(xì)菌素bifidocin A的四步提取純化方法:硫酸銨鹽析--SP Sepharose Fast Flow陽(yáng)離子交換色譜--葡聚糖凝膠G-10層析色譜--C18反相高效液相色譜。純化后得到的細(xì)菌素比活力高達(dá)5535 AU/mg,純化倍數(shù)達(dá)到115倍。(4)特性試驗(yàn)結(jié)果顯示:雙歧桿菌細(xì)菌素bifidocin A可在50-100℃處理30min后保留70%以上活性,121℃加熱20min活性殘留50%以上;在pH3.0-8.0范圍比較穩(wěn)定,活性可保留60%以上,pH2.0環(huán)境中只能發(fā)揮30%的抑菌作用,pH11.0使其完全失活;對(duì)蛋白酶K、酸性蛋白酶和胃蛋白酶十分敏感,胰蛋白酶和中性蛋白酶可使其部分失活;該細(xì)菌素有較寬抑菌譜,可抑制多種G+菌、G-菌、真菌,尤其大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、李斯特菌、丁酸梭菌、芽孢桿菌、藤黃微球菌、熱死環(huán)絲菌、酵母菌等。同時(shí),確定細(xì)菌素bifidocin A的作用方式為短時(shí)間迅速殺菌,其最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)分別為640AU/mL和2560AU/m L。此外,細(xì)菌素對(duì)指示菌細(xì)胞吸附效果受溫度和時(shí)間影響較小,受pH和鹽離子濃度影響較大。(5)分子結(jié)構(gòu)測(cè)定結(jié)果可知:雙歧桿菌細(xì)菌素bifidocin A的分子量為1198.7Da;N端前10個(gè)氨基酸序列為Val Phe His Pro Gly Thr Gly Pro Pro Gly(VFHPGTGPPG),推測(cè)未測(cè)出的氨基酸可能是Asp(D)和Leu(L);bifidocin A二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為含量58%以上的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)、27%左右的β折疊結(jié)構(gòu)和12%左右的β轉(zhuǎn)角,且其在親水環(huán)境和疏水環(huán)境中結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化,是一種非規(guī)則蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的新型三級(jí)結(jié)構(gòu)。綜上所述,研究所得雙歧桿菌BB04為國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道產(chǎn)細(xì)菌素動(dòng)物雙歧桿菌菌株,該菌株所產(chǎn)細(xì)菌素bifidocin A不僅抑菌譜廣、抑菌活性強(qiáng)、安全性高,而且具有很好的食品加工特性,有作為天然食品防腐劑的巨大應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：雙歧桿菌 細(xì)菌素 提純 特性 分子結(jié)構(gòu)
【學(xué)位授予單位】：北京工商大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：TS201.3
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 第1章 緒論11-19
• 1.1 研究背景11-15
• 1.1.1 天然食品防腐劑11-12
• 1.1.2 乳酸菌細(xì)菌素12-15
• 1.1.2.1 乳酸菌細(xì)菌素結(jié)構(gòu)12
• 1.1.2.2 乳酸菌細(xì)菌素生物合成12-13
• 1.1.2.3 乳酸菌細(xì)菌素特性13-14
• 1.1.2.4 乳酸菌細(xì)菌素作用機(jī)制14
• 1.1.2.5 乳酸菌細(xì)菌素在食品中的應(yīng)用14-15
• 1.2 研究現(xiàn)狀15-18
• 1.2.1 雙歧桿菌細(xì)菌素的產(chǎn)生及特性16-17
• 1.2.2 雙歧桿菌細(xì)菌素的提取純化17-18
• 1.2.3 雙歧桿菌細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)18
• 1.3 本課題研究目的及任務(wù)18-19
• 第2章 產(chǎn)細(xì)菌素優(yōu)良雙歧桿菌的篩選19-30
• 2.1 試驗(yàn)材料與方法19-25
• 2.1.1 試驗(yàn)材料19-20
• 2.1.1.1 菌種取材樣品19
• 2.1.1.2 指示菌19
• 2.1.1.3 培養(yǎng)基19
• 2.1.1.4 藥品試劑19-20
• 2.1.1.5 儀器設(shè)備20
• 2.1.2 試驗(yàn)方法20-25
• 2.1.2.1 雙歧桿菌的篩選21-22
• 2.1.2.2 產(chǎn)細(xì)菌素雙歧桿菌菌株的篩選22
• 2.1.2.3 產(chǎn)細(xì)菌素的初步鑒定22-23
• 2.1.2.4 產(chǎn)細(xì)菌素優(yōu)良雙歧桿菌菌株的鑒定23-24
• 2.1.2.5 細(xì)菌素效價(jià)分析24-25
• 2.2 試驗(yàn)結(jié)果與分析25-28
• 2.2.1 雙歧桿菌的篩選25
• 2.2.2 產(chǎn)細(xì)菌素雙歧桿菌菌株的篩選25
• 2.2.3 產(chǎn)細(xì)菌素的初步鑒定25-26
• 2.2.3.1 產(chǎn)細(xì)菌素雙歧桿菌優(yōu)良菌株的復(fù)篩25-26
• 2.2.3.2 雙歧桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的鑒定26
• 2.2.4 產(chǎn)細(xì)菌素優(yōu)良雙歧桿菌菌株BB04的鑒定26-28
• 2.2.4.1 形態(tài)學(xué)觀察26-27
• 2.2.4.2 生理生化檢驗(yàn)27
• 2.2.4.3 16S rDNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建27-28
• 2.2.5 細(xì)菌素效價(jià)分析標(biāo)準(zhǔn)曲線28
• 2.3 討論28-29
• 2.4 結(jié)論29-30
• 第3章 雙歧桿菌產(chǎn)bifidocin A的發(fā)酵條件優(yōu)化30-40
• 3.1 材料與方法30-32
• 3.1.1 試驗(yàn)材料30-31
• 3.1.1.1 菌株和培養(yǎng)基30
• 3.1.1.2 藥品試劑30
• 3.1.1.3 儀器設(shè)備30-31
• 3.1.2 試驗(yàn)方法31-32
• 3.1.2.1 抑菌試驗(yàn)方法31
• 3.1.2.2 雙歧桿菌代謝產(chǎn)bifidocin A的最適發(fā)酵條件的確定31-32
• 3.2 試驗(yàn)結(jié)果與分析32-39
• 3.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果32-36
• 3.2.1.1 雙歧桿菌BB04的生長(zhǎng)曲線及其抑菌活性曲線32-33
• 3.2.1.2 接種量對(duì)雙歧桿菌BB04代謝產(chǎn)bifidocin A的影響33
• 3.2.1.3 起始pH對(duì)雙歧桿菌BB04代謝產(chǎn)bifidocin A的影響33-34
• 3.2.1.4 培養(yǎng)溫度對(duì)雙歧桿菌BB04代謝產(chǎn)bifidocin A的影響34-35
• 3.2.1.5 促雙歧因子對(duì)雙歧桿菌BB04代謝產(chǎn)bifidocin A的影響35-36
• 3.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化雙歧桿菌BB04代謝產(chǎn)bifidocin A發(fā)酵條件36-39
• 3.3 討論39
• 3.4 結(jié)論39-40
• 第4章 雙歧桿菌細(xì)菌素bifidocin A的提取純化40-49
• 4.1 試驗(yàn)材料與方法40-43
• 4.1.1 試驗(yàn)材料40-41
• 4.1.1.1 樣品40
• 4.1.1.2 指示菌40
• 4.1.1.3 藥品試劑40
• 4.1.1.4 儀器設(shè)備40-41
• 4.1.2 試驗(yàn)方法41-43
• 4.1.2.1 抑菌實(shí)驗(yàn)方法41
• 4.1.2.2 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法41
• 4.1.2.3 提取純化程序及方法41-43
• 4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析43-47
• 4.2.1 硫酸銨鹽析法粗提43
• 4.2.2 陽(yáng)離子交換色譜43-44
• 4.2.3 葡聚糖凝膠色譜44-45
• 4.2.4 反相高效液相色譜45-47
• 4.3 討論47
• 4.4 結(jié)論47-49
• 第5章 雙歧桿菌細(xì)菌素bifidocin A的特性研究49-63
• 5.1 材料與方法49-52
• 5.1.1 試驗(yàn)材料49-50
• 5.1.1.1 樣品49
• 5.1.1.2 指示菌49
• 5.1.1.3 藥品試劑49-50
• 5.1.1.4 儀器設(shè)備50
• 5.1.2 試驗(yàn)方法50-52
• 5.1.2.1 抑菌實(shí)驗(yàn)方法50
• 5.1.2.2 理化特性研究50-51
• 5.1.2.3 抑菌譜測(cè)定51
• 5.1.2.4 作用方式的確定51
• 5.1.2.5 吸附特性研究51-52
• 5.2 試驗(yàn)結(jié)果與分析52-60
• 5.2.1 理化特性研究52-55
• 5.2.1.1 熱穩(wěn)定性研究52-53
• 5.2.1.2 酸堿耐受性研究53-54
• 5.2.1.3 蛋白酶敏感性研究54-55
• 5.2.2 抑菌譜55-57
• 5.2.3 作用方式的確定57-58
• 5.2.3.1 作用方式測(cè)定57
• 5.2.3.2 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度測(cè)定57-58
• 5.2.4 吸附特性研究58-60
• 5.2.4.1 溫度對(duì)bifidocin A吸附特性的影響58
• 5.2.4.2 pH對(duì)bifidocin A吸附特性的影響58-59
• 5.2.4.3 時(shí)間對(duì)bifidocin A吸附特性的影響59-60
• 5.2.4.4 鹽離子對(duì)bifidocin A吸附特性的影響60
• 5.3 討論60-61
• 5.4 結(jié)論61-63
• 第6章 雙歧桿菌細(xì)菌素bifidocin A的分子結(jié)構(gòu)初探63-72
• 6.1 材料與方法63-65
• 6.1.1 試驗(yàn)材料63-64
• 6.1.1.1 樣品63
• 6.1.1.2 藥品試劑63
• 6.1.1.3 儀器設(shè)備63-64
• 6.1.2 試驗(yàn)方法64-65
• 6.1.2.1 分子量測(cè)定64
• 6.1.2.2 氨基酸組成測(cè)定64
• 6.1.2.3 氨基酸序列的測(cè)定64-65
• 6.1.2.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定和三級(jí)結(jié)構(gòu)初探65
• 6.2 試驗(yàn)結(jié)果與分析65-70
• 6.2.1 分子量測(cè)定65-66
• 6.2.2 氨基酸組成測(cè)定66
• 6.2.3 氨基酸序列測(cè)定66-67
• 6.2.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定和三級(jí)結(jié)構(gòu)初探67-70
• 6.3 討論70-71
• 6.4 結(jié)論71-72
• 第7章 全文總結(jié)與展望72-74
• 7.1 全文總結(jié)72-73
• 7.2 展望73-74
• 參考文獻(xiàn)74-79
• 在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及研究成果79-80
• 致謝80

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7 李碩;Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素的克隆表達(dá)研究[D];江南大學(xué);2009年

8 崔建超;乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素的生物學(xué)特性及其在乳品中的應(yīng)用[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

9 石金舟;產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選鑒定和細(xì)菌素發(fā)酵條件的研究[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

10 常峰;類細(xì)菌素產(chǎn)生菌的選育及其發(fā)酵產(chǎn)物性質(zhì)的初步研究[D];四川大學(xué);2006年

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本文編號(hào)：881118