本文關(guān)鍵詞：人精液和卵泡液中抑制素B（INH-B）的分離純化與鑒定研究

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【摘要】：研究背景：血清抑制素B(INH-B)的檢測(cè)在男性不育癥的診治中已逐漸得到廣泛的應(yīng)用。一般認(rèn)為INH-B更能直接反映睪丸的生精功能,并具有無(wú)創(chuàng)性的優(yōu)點(diǎn),可作為評(píng)價(jià)男性生育力的重要指標(biāo),諸如預(yù)測(cè)非阻塞性無(wú)精癥患者行睪丸穿刺能否獲得精子的參考依據(jù)。目前國(guó)際國(guó)內(nèi)應(yīng)用的血清INH-B檢測(cè)試劑盒幾乎全是英國(guó)DSL公司的產(chǎn)品,且價(jià)格昂貴。DSL公司以Groome NP實(shí)驗(yàn)室的雄厚研究基礎(chǔ)為支撐,將其研究結(jié)果成功轉(zhuǎn)化。查閱文獻(xiàn)凡INH-B研究所用的抗體最初都是該實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。在90's年代開(kāi)發(fā)出第一代INH-B ELISA檢測(cè)試劑盒,在2000年又改進(jìn)推出第二代產(chǎn)品。本研究課題的立項(xiàng)源于市場(chǎng)的需求,因國(guó)內(nèi)尚無(wú)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的INH-B檢測(cè)試劑盒,在某試劑公司的要求下進(jìn)行合作開(kāi)發(fā)國(guó)產(chǎn)化產(chǎn)品。研究目的：制備高特異性、高親和力的單克隆抗體是研發(fā)的核心問(wèn)題。因此,本研究將集中開(kāi)展INH-B單抗制備的關(guān)鍵步驟與必要條件的探索。研究表明,男性體內(nèi)IN的重要生理活性形式為INH-B,其組裝過(guò)程大部分在生精細(xì)胞內(nèi)完成,然后釋放到循環(huán)系統(tǒng)和精液中。女性卵泡液中INH-B的含量為幾十ng/ml～幾百ng/ml,比血液及精液中的含量高約103倍本實(shí)驗(yàn)擬嘗試從人精液和/或人卵泡液中分離純化INH-B,為單抗的篩選提供天然抗原分子。由于對(duì)人精液和卵泡液中INH-B的研究相對(duì)薄弱,更多的研究資料來(lái)源于動(dòng)物,因此本研究還將對(duì)其存在形式和理化性質(zhì)獲得更直接的資料。主要目的有三個(gè)：1.探索人精液和卵泡液中INH-B的有效分離純化方法。2.鑒定人精液和卵泡液中INH-B的可能分子存在形式。3.擴(kuò)大人卵泡液中蛋白質(zhì)組成的信息資料。研究路線與方法：1.目的蛋白的富集：采用人精液和卵泡液為研究材料,分別利用乙腈、丙酮、乙醇三種有機(jī)溶劑沉淀法去除樣品中的高豐度蛋白,富集低豐度蛋白INH-B,以及利用飽和硫酸銨分級(jí)沉淀方法,比較四種方法對(duì)于低豐度目的蛋白INH-B的富集效果。以INH-B ELISA檢測(cè)盒的結(jié)果為依據(jù),跟蹤監(jiān)測(cè)并比較四種方法對(duì)于低豐度目的蛋白INH-B的富集效果。2.選用DEAE-Sephadex A-50陰離子交換柱和羥基磷灰石柱層析、肝素親和柱方法,分離初步富集的樣品以進(jìn)一步純化。同樣方法監(jiān)測(cè)并比較三種方法對(duì)于樣品的分離純化效果。3.利用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)分離法(Rotofor System)對(duì)富集樣品和柱分離樣品分別做等電分離比較,以確定柱分離步驟的有效性,同時(shí)鑒定INH-B的等電點(diǎn)。4.利用免疫共沉淀(CO-IP)和Western-blot方法尋找陽(yáng)性條帶,利用質(zhì)譜分析方法鑒定樣品中INH-B的α、βB兩個(gè)亞基的分子存在形式及成熟卵泡液中部分蛋白質(zhì)的組成。研究結(jié)果：1.由于精液特殊的粘稠性(含大量的精膠蛋白),在對(duì)其進(jìn)行有機(jī)溶劑蛋白沉淀和飽和硫酸銨分級(jí)沉淀的過(guò)程中,去除精膠蛋白的同時(shí)會(huì)損失大部分的INH-B。因此,經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后,我們放棄了對(duì)于精液中INH-B的分離純化和鑒定研究。2.卵泡液樣品經(jīng)丙酮、乙醇、乙腈處理后分別可清除60.9%、46.3%、88.7%的高豐度蛋白,同時(shí)乙腈法能回收61.8%的INH-B。3.通過(guò)比較肝素親和柱方法、DEAE-Sephadex A-50陰離子交換柱和羥基磷灰石柱層析三種方法,其中第二種方法最穩(wěn)定,并且能回收樣品中83.2%的INH-B。4.乙腈沉淀處理的卵泡樣品中仍有較多的雜蛋白,因此,經(jīng)DEAE-Sephadex A-50陰離子交換柱處理后的樣品比直接用乙腈沉淀樣品做Rotofor System分離的效果要好。其中,INH-B的回收率為75.3%,卵泡液中INH-B的pI在4.55左右。5.通過(guò)質(zhì)譜方法,鑒定出六種成熟卵泡液中存在的蛋白質(zhì),分別是載脂蛋白D(Apolipoprotein D)、載脂蛋白A(Apolipoprotein A)、載脂蛋白M(ApolipoproteinM)、視黃醇結(jié)合蛋白4 (Retinol-binding protein 4)、甲狀腺素運(yùn)載蛋白(Transthyretin OS)、SERPINA1蛋白Alpha型抗胰蛋白酶(SERPINA1 Isoform 2 of Alpha-1-antitrypsin)。結(jié)論：1.卵泡液是INH-B研究的最合適材料。同時(shí),利用乙腈法處理卵泡原液去除高豐度蛋白是最有效的方法并能保留較多的INH-B。2.使用人卵泡液為實(shí)驗(yàn)材料,利用INH-B本身的生化性質(zhì),通過(guò)乙腈富集、陰離子交換柱分離、等電點(diǎn)分離的“三步分離法”,初步純化獲得人體卵泡液中天然INH-B蛋白分子粗制品,純化回收率達(dá)38.7%,并較準(zhǔn)確鑒定出其在人體中的等電點(diǎn)為4.55。3.利用現(xiàn)有的商品化抗體并沒(méi)有鑒定出在精液和卵泡液中INH-B的分子存在形式。但經(jīng)多個(gè)步驟純化已經(jīng)獲得相對(duì)含量較高的INH-B粗制品,該產(chǎn)物能否滿足作為抗原供篩選單抗之用,有待進(jìn)一步研究。4.利用質(zhì)譜方法明確鑒定了成熟卵泡液中部分蛋白質(zhì)組成,六種分子。
【關(guān)鍵詞】：人精液 人卵泡液 抑制素B質(zhì)譜 蛋白質(zhì) 分離 純化
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R3411
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-10
• 前言10-14
• 實(shí)驗(yàn)材料14-16
• 實(shí)驗(yàn)方法16-25
• 1. 精液和卵泡液樣本的收集16
• 2. Bradford法測(cè)總蛋白質(zhì)濃度16
• 3. 去除卵泡液中的高豐度蛋白16
• 4. 飽和硫酸銨分級(jí)沉淀處理精液和卵泡液樣品16-17
• 5. 蛋白樣品的透析和濃縮17
• 6. SDS-PAGE分離樣品蛋白17
• 7. 非變性NATIVE-PAGE膠17-19
• 8. 等電聚膠電泳(IEF)實(shí)驗(yàn)方法19-20
• 9. DEAE-Sephadex A-50柱層析純化方法20-21
• 10. 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)分離法(Rotofor System)21
• 11. INH-B的Western-blot檢測(cè)21-22
• 12. INH-B蛋白成分的檢測(cè)22
• 13. 質(zhì)譜鑒定22-25
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-38
• 1. 三種去除卵泡液中的高豐度蛋白方法的比較結(jié)果25-26
• 2. 去除精液中高豐度蛋白方法的比較結(jié)果26-27
• 3. 飽和硫酸銨分級(jí)沉淀法處理精液和卵泡液樣品結(jié)果27-28
• 4. 非變性膠蛋白電泳分離及洗脫結(jié)果28-30
• 5. IEF實(shí)驗(yàn)結(jié)果30
• 6. 肝素親和柱純化目的蛋白結(jié)果30-31
• 7. DEAE-Sephadex A-50柱層析純化蛋白結(jié)果31
• 8. Rotofor System蛋白分離及等電點(diǎn)鑒定結(jié)果31-33
• 9. 目的蛋白INH-B的回收率33-34
• 10. 質(zhì)譜分析結(jié)果34-38
• 討論38-41
• 小結(jié)41-43
• 參考文獻(xiàn)43-47
• 文獻(xiàn)綜述47-53
• 參考文獻(xiàn)50-53
• 附錄53-60
• 致謝60-61

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 董志英,孫輝臣;血清抑制素B與睪丸生精功能關(guān)系的研究進(jìn)展[J];華北國(guó)防醫(yī)藥;2004年06期

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本文編號(hào)：771784