目的對從膝關(guān)節(jié)軟骨損傷區(qū)分離出的細胞進行鑒定,并對其生長活性進行研究,以解決自體軟骨細胞移植中軟骨細胞來源不足的問題。方法通過膝關(guān)節(jié)鏡,在軟骨損傷區(qū)取少量損傷軟骨組織,不含正常軟骨及軟骨下骨為實驗組;取正常軟骨組織為對照組。在胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶作用下從實驗組中提取細胞,對照組中提取正常軟骨細胞。實驗組細胞培養(yǎng)貼壁后在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)是否與對照組軟骨細胞一致。實驗組細胞行甲苯胺藍染色鑒定,與對照組對比;噻唑藍（MTT）法比較兩組細胞生長活性;以具有專利知識產(chǎn)權(quán)的Ⅰ/Ⅱ型復合膠原膜為生長載體,培養(yǎng)實驗組和對照組第3代軟骨細胞,在電鏡下觀察兩組生長活性。結(jié)果從少量損傷的軟骨組織中提取的細胞為活性正常的軟骨細胞,其特征及生長活性與對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論軟骨損傷過程中軟骨細胞未發(fā)生變性,少量損傷的軟骨組織仍可獲得適量軟骨細胞,MTT法和電鏡掃描表明,其生長活性符合自體軟骨細胞移植的要求,無需取正常軟骨組織作為細胞來源。 

【文章來源】：中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志. 2017,27(23)北大核心

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

關(guān)節(jié)鏡下軟骨損傷區(qū)19·

中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志第27卷實驗組對照組圖3兩組第3代細胞（甲苯胺藍染色×400）驗組和對照組進行比較是否符合軟骨細胞生長特性,實驗組應(yīng)注意觀察有無長梭形的纖維樣細胞。1.2.5甲苯胺藍染色鑒定將實驗組培養(yǎng)至第2代的細胞傳代后，放入含蓋玻片的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h。PBS緩沖液清洗爬片2次，4%多聚甲醛溶液固定15～20min、0.1%甲苯胺藍染液浸泡2h，90%無水乙醇漂洗，鏡下觀察。1.2.6MTT法為保證足夠數(shù)量的細胞完成實驗，實驗組和對照組細胞第2、3代測吸光度值（opticaldensity，OD），每代細胞均按2×104個/ml接種至6塊96孔板，100μg（/ml·孔），每板分為實驗組和對照組，每組接種6孔。每隔2天換液，每隔1天取1塊96孔板分別測實驗組和對照組每孔OD值,測1次/（板·孔），共測6次。加入MTT溶液（5mg/ml）10μl/孔，培養(yǎng)箱孵育4h后加入100μlDMSO，在搖床上低速震蕩10min，在酶聯(lián)免疫吸附檢測儀490nm處測各孔吸光度值，取每組平均值。1.2.7電鏡電鏡觀察比較兩組細胞生長情況。兩組細胞分別取第3代細胞，接種至含有Ⅰ/Ⅱ型復合膠原膜的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)3d[7]，細胞懸液鋪滿培養(yǎng)皿底。3d后，將復合膠原膜從培養(yǎng)皿中取出，PBS緩沖液漂洗，2.5%戊二醛、1%鋨酸雙固定，濃度逐級增高的乙醇脫水、臨界點干燥，噴金導電后掃描電鏡觀察。1.3統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，用兩獨立樣本的t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1軟骨細胞計數(shù)及存活率實驗組軟骨重量約為85mg，細胞濃度約為2.7136×104個/ml；對照組軟骨重量約為85mg，細胞濃度約為3.5248×104個/ml；從軟骨組織中獲得細胞比率：實驗組∶對照組的細胞提取比率1.0000∶1.2989。實驗組臺盼藍染色測定細胞

中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志第27卷實驗組對照組圖3兩組第3代細胞（甲苯胺藍染色×400）驗組和對照組進行比較是否符合軟骨細胞生長特性,實驗組應(yīng)注意觀察有無長梭形的纖維樣細胞。1.2.5甲苯胺藍染色鑒定將實驗組培養(yǎng)至第2代的細胞傳代后，放入含蓋玻片的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h。PBS緩沖液清洗爬片2次，4%多聚甲醛溶液固定15～20min、0.1%甲苯胺藍染液浸泡2h，90%無水乙醇漂洗，鏡下觀察。1.2.6MTT法為保證足夠數(shù)量的細胞完成實驗，實驗組和對照組細胞第2、3代測吸光度值（opticaldensity，OD），每代細胞均按2×104個/ml接種至6塊96孔板，100μg（/ml·孔），每板分為實驗組和對照組，每組接種6孔。每隔2天換液，每隔1天取1塊96孔板分別測實驗組和對照組每孔OD值,測1次/（板·孔），共測6次。加入MTT溶液（5mg/ml）10μl/孔，培養(yǎng)箱孵育4h后加入100μlDMSO，在搖床上低速震蕩10min，在酶聯(lián)免疫吸附檢測儀490nm處測各孔吸光度值，取每組平均值。1.2.7電鏡電鏡觀察比較兩組細胞生長情況。兩組細胞分別取第3代細胞，接種至含有Ⅰ/Ⅱ型復合膠原膜的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)3d[7]，細胞懸液鋪滿培養(yǎng)皿底。3d后，將復合膠原膜從培養(yǎng)皿中取出，PBS緩沖液漂洗，2.5%戊二醛、1%鋨酸雙固定，濃度逐級增高的乙醇脫水、臨界點干燥，噴金導電后掃描電鏡觀察。1.3統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，用兩獨立樣本的t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1軟骨細胞計數(shù)及存活率實驗組軟骨重量約為85mg，細胞濃度約為2.7136×104個/ml；對照組軟骨重量約為85mg，細胞濃度約為3.5248×104個/ml；從軟骨組織中獲得細胞比率：實驗組∶對照組的細胞提取比率1.0000∶1.2989。實驗組臺盼藍染色測定細胞

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3577147