本文選題：抗草甘膦 + EPSPS��； 參考：《山東大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：草甘膦因為其高效性、廣譜性、內(nèi)吸傳導(dǎo)型、低毒等特點,是當今農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用面積最廣、生產(chǎn)銷量最大、最具商業(yè)價值的的一種除草劑。其作用的機制是通過競爭性的抑制植物莽草酸途徑的關(guān)鍵酶5-烯醇丙酮莽草酸-3磷酸合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase,簡稱EPSP合成酶)的催化作用阻斷植物芳香族氨基酸的合成,進而導(dǎo)致植物失綠死亡。此外,由于草甘膦具有非選擇性,在殺滅雜草的同時會對田間作物也造成傷害,所以通過分子育種途徑培育抗草甘膦作物是雜草防治的重要手段之一。通過將抗草甘膦的EPSPS基因?qū)胱魑?可獲得具有草甘膦抗性的轉(zhuǎn)基因品種。玉米(Zea mays.L)作為全球產(chǎn)量最大的的糧食作物,同時又是重要的飼料、經(jīng)濟和能源作物,在全世界廣泛種植。隨著抗性雜草的不斷產(chǎn)生,原有的除草劑使用效果欠佳,草害對玉米產(chǎn)量的影響愈發(fā)明顯,培育抗草甘膦玉米對于提高玉米產(chǎn)量和品質(zhì)有著重要的現(xiàn)實意義。本實驗所用的抗草甘膦基因EPSPS來源于可變鹽單胞菌(Halomonas varabilis)(簡稱H Var-EPSPS)。為了提高轉(zhuǎn)基因玉米的的草甘膦抗性,首先對H.Var-EPSPS基因序列依據(jù)玉米密碼子偏倚性進行優(yōu)化,然后利用重疊延伸法對優(yōu)化后的cDNA序列進行定點突變獲得了兩個修飾的H.Var-EPSPS基因序列,即EPSPSM1和EPSPSM2。EPSPSM1是將第295位堿基由胸腺嘧啶(T)突變?yōu)轼B嘌呤(G),第299位堿基由鳥嘌呤(G)突變?yōu)榘奏?C),使其編碼的氨基酸序列發(fā)生變化。即第99位絲氨酸(Ser)突變?yōu)楸彼?Ala),100位甘氨酸(Gly)突變?yōu)楸彼?Ala)。EPSPSM2是在EPSPSMl的基礎(chǔ)上再將第292位堿基由鳥嘌呤(A)突變?yōu)樾叵汆奏?T),即將第98位天冬酰胺(Ash)突變?yōu)槔野彼?Tyr)。通過三維結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn),EPSPSM1和EPSPSM2在與底物結(jié)合的位點處構(gòu)象發(fā)生了變化。為了驗證突變后的H.Var-EPSPS是否能提高轉(zhuǎn)基因玉米草甘膦抗性,分別將EPSPSM1和EPSPSM2基因插入以玉米ubiquitin啟動子啟動、水稻GluB5基因的3’UTR為終止子的表達插盒中,并將該插盒重組到以bar基因作為篩選標記的植物表達載體中。其中bar為依據(jù)玉米密碼子偏倚性進行過優(yōu)化的基因,由增強型CaMV35S啟動子啟動,以水稻GluB5基因的3’UTR終止。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米無菌幼苗莖尖轉(zhuǎn)化法,將兩個帶有目的基因的植物表達載體分別轉(zhuǎn)化入玉米骨干自交系昌7-2中,獲得了具有雙重除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因玉米植株。轉(zhuǎn)基因玉米的分子生物學(xué)驗證首先利用PCR的方法檢測轉(zhuǎn)基因玉米的bar基因和EPSPSM1或EPSPSM2基因,確定它們已整合到了玉米基因組。在T1代抗性植株檢測中,C72-M1的76株TO植株的自交后代中,有32個株系檢測到bar基因和EPSPSM1基因,陽性率為42.1%；在C72-M2的70株T0植株自交后代中,有29個株系檢測到bar基因和EPSPSM2基因,陽性率為41.4%。對T1代轉(zhuǎn)基因陽性植株自交結(jié)籽,通過逐代的除草劑篩選和PCR檢測獲得了轉(zhuǎn)基因純合的T3代植株。然后通過Western Blot的方法檢測轉(zhuǎn)基因編碼產(chǎn)物EPSPSM1和PSPSM2在T3代轉(zhuǎn)基因植株中組成型表達。轉(zhuǎn)基因玉米的除草劑抗性鑒定在轉(zhuǎn)基因玉米除草劑抗性鑒定中,將本課題中產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因玉米和未優(yōu)化的H. Var-EPSPS轉(zhuǎn)基因玉米、進行過玉米密碼子偏倚性修飾的H.Var-EPSPS轉(zhuǎn)基因玉米同時進行草甘膦處理,以確定基因突變的效果。在玉米植株4葉期時噴施有效成分為2.52 kg ae ha-1草甘膦,即田間標準使用劑量的3倍,觀測植株生長狀況及成活率。結(jié)果表明本實驗培育的轉(zhuǎn)基因植株仍能保持良好的生長狀態(tài),即突變過的EPSPSM1或EPSPSM2確實提高了轉(zhuǎn)基因植株的草甘膦抗性。同時轉(zhuǎn)基因植株還具有良好的草丁膦抗性,3葉期可耐0.412kg ae ha-1的草丁膦處理。我們獲得了兼抗兩種不同作用機制除草劑的轉(zhuǎn)基因玉米純合系。在玉米田間雜草防治中,可以選擇性地噴施一種或兩種除草劑或噴灑混合除草劑溶液來控制雜草,不僅能高效控制草害,而且可有效推遲抗性雜草的進化。本實驗獲得的具有雙重除草劑抗性的的轉(zhuǎn)基因玉米,為培育我國具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗除草劑玉米品種奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Because of its high efficiency , broad spectrum , internal suction conduction type and low toxicity , it is one of the most widely used herbicides in agricultural production . In order to improve glyphosate resistance of transgenic maize , we firstly optimized the sequence of H . Var - EPSPS gene according to the bias of maize codon , and then mutated it to guanine ( G ) from guanine ( G ) by overlapping extension method .
The expression of EPSPSM1 and PSPSM2 in transgenic maize was detected by Western Blot . The results showed that the mutant EPSPSM1 or EPSPSM2 improved the glyphosate resistance of transgenic plants . The results showed that the mutant EPSPSM1 or EPSPSM2 improved the glyphosate resistance of transgenic plants .
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S513

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本文編號：1953894