本文選題：轉(zhuǎn)座子　切入點：整合效率　出處：《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2014年博士后論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：轉(zhuǎn)座是一種普遍的生物現(xiàn)象,是生物進(jìn)化的一種重要機(jī)制,也是決定生物基因組差異的重要因素之一。在長期進(jìn)化中,轉(zhuǎn)座子在不同生物基因組中產(chǎn)生了很大的差異,在哺乳動物中主要活性轉(zhuǎn)座子是反轉(zhuǎn)錄座子L1和ERV,而鳥類ERV可能還有一定活性。哺乳動物和鳥類中活性DNA轉(zhuǎn)座子很少,但在魚類基因組中存在大量的活性DNA轉(zhuǎn)座子。由于一些活性DNA轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)簡單,且能夠通過剪切-粘貼等機(jī)制在在基因組上移動,因此被作為非常有效的基因操作工具進(jìn)行開發(fā)利用,如Sleeping Beauty (SB)轉(zhuǎn)座子,目前研究應(yīng)用較廣泛的DNA轉(zhuǎn)座子是SB、PB和To12,在人類基因治療、轉(zhuǎn)基因制備和功能基因組學(xué)研究上的已經(jīng)取得一些重要進(jìn)展。但目前對這些轉(zhuǎn)座子的插入偏好性和轉(zhuǎn)座活性,以及在細(xì)胞質(zhì)顯微注射中的具體技術(shù)參數(shù)等理解仍然不夠深入細(xì)致,需要優(yōu)化完善；且我國存在對自主知識產(chǎn)權(quán)轉(zhuǎn)座子研發(fā)不足等問題,本研究針對以上這些問題,系統(tǒng)研究比較了這三種轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在細(xì)胞和胚胎水平上的轉(zhuǎn)座活性差異,同時對轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)顯微注射相關(guān)技術(shù)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,為該技術(shù)在動物轉(zhuǎn)基因、基因治療和功能基因組學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用研究提供參考。研究同時嘗試?yán)蒙镄畔W(xué)手段,進(jìn)行高活性DNA轉(zhuǎn)座子的挖掘,為建立自主知識產(chǎn)權(quán)轉(zhuǎn)座子技術(shù)積累基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：1.將pT3-PGK-NEO轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒和SB、Tol2、PB轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒分別按不同比例混合共轉(zhuǎn)染MEF和HELA細(xì)胞,進(jìn)行了SB、PB、Tol2整合效率比較。經(jīng)G418選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選10-15d后,結(jié)果表明：MEF、HELA細(xì)胞中To12、PB轉(zhuǎn)座子均在2：1比例時形成的克隆數(shù)最多,整合效率最高,而SB轉(zhuǎn)座子在1：1比例時形成的克隆數(shù)最多,整合效率最高；且在各組合比例下,SB的整合效率均高于PB和To12,活性最高時,SB的整合效率顯著高于PB和To12(p0.05),而PB的整合效率要高于To12。2.將pT3-NEO-T rap轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒和SB、Tol2、PB轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒分別按不同比例混合共轉(zhuǎn)染MEF和HELA細(xì)胞,進(jìn)行了SB、PB、Tol2基因捕獲效率比較。經(jīng)G418選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選10-15d后,比較各組細(xì)胞克隆數(shù),結(jié)果表明：轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶比例為2：1時捕獲效率最高。PB的捕獲效率最高,且在HELA細(xì)胞中顯著高于SB和To12(p0.05)。3.將pT3-CAG-GFP質(zhì)粒(20ng)和SB、Tol2、PB三種轉(zhuǎn)座酶的mRNA按濃度10ng,30ng,50ng分別混和,進(jìn)行小鼠受精卵細(xì)胞質(zhì)注射,培養(yǎng)至4天進(jìn)行熒光檢測,在胚胎水平比較轉(zhuǎn)座活性差異,結(jié)果表明三種轉(zhuǎn)座子GFP陽性胚胎率都在30%以上,其中PB在轉(zhuǎn)座酶mRNA濃度50ng/ul時GFP陽性率最高,達(dá)到50%以上顯著高于10ng/ul和30ng/ul組(p0.05),且顯著高于SB和To12轉(zhuǎn)座子(p0.05)；SB和To12在轉(zhuǎn)座酶mRNA濃度30ng/ul時GFP陽性率最高,分別為45.00%和37.16%。To12轉(zhuǎn)座子相對低于SB和PB轉(zhuǎn)座子。4.通過斑馬魚、青溕、刺魚、金娃娃4個代表性硬骨魚類轉(zhuǎn)座組解析發(fā)現(xiàn),硬骨魚類轉(zhuǎn)座子多樣性程度和轉(zhuǎn)座活性很高,是活躍基因組,基因組大小差異主要是由轉(zhuǎn)座組的不同程度擴(kuò)張引起的,而轉(zhuǎn)座組差異主要由于DNA轉(zhuǎn)座子的不同程度擴(kuò)張引起的。其中兩個DNA超家族轉(zhuǎn)座子(hAT和Tcl/Mariner)是硬骨魚轉(zhuǎn)座組擴(kuò)張的主要成份,且hAT和Tcl/Mariner超家族轉(zhuǎn)座子均存在多個結(jié)構(gòu)完整的成員存在,提示其是活躍家族。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子家族在四個物種擴(kuò)張也存在較大差異,在斑馬魚和刺魚基因組中發(fā)現(xiàn)多個活性很強(qiáng)的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(DIRS、Gypsy、L1及L2)。5.通過生物信息分析及細(xì)胞和胚胎實驗驗證,結(jié)果表明在斑馬魚基因組中Tel轉(zhuǎn)座子的各成員活性存在較大差異,其中Tcl-c是最年輕轉(zhuǎn)座子,能夠在哺乳動物MEF和HELA細(xì)胞中有效轉(zhuǎn)座,并在鼠胚胎有效介導(dǎo)GFP基因轉(zhuǎn)移,其活性與現(xiàn)有的SB轉(zhuǎn)座子的活性相近�？傮w而言,本研究結(jié)果表明,在細(xì)胞水平,SB的整合效率最高,而PB的基因捕獲效率最高。在胚胎水平,PB轉(zhuǎn)基因效率最高。新發(fā)現(xiàn)的斑馬魚Tcl-c轉(zhuǎn)座子具有較高的轉(zhuǎn)座活性,具有應(yīng)用前景。本研究同時證實轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)顯微注射技術(shù)具有可行性,且獲得一系列細(xì)胞和胚胎水平的優(yōu)化轉(zhuǎn)座子技術(shù)參數(shù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士后
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：Q78

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本文編號：1619592