本文選題：cRGD-siRNA　切入點(diǎn)：腫瘤靶向性　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景 siRNA,作為RNAi中重要組成部分,基于天然的細(xì)胞內(nèi)基因沉默功能和降低靶基因表達(dá)的強(qiáng)有力工具,使其成為一種具有重大研究前景的新型治療策略。目前已被廣泛用于各種疾病治療的基礎(chǔ)研究。作為一種新興的治療技術(shù),以一種前所未有的速度邁進(jìn)了臨床試驗(yàn)階段。任何與疾病有關(guān)的表達(dá)基因都是潛在的靶標(biāo),從家族遺傳疾病到腫瘤,再到病毒感染等。然而面臨的一些亟待解決的問(wèn)題限制了其在臨床中的應(yīng)用,包括siRNA分子在體內(nèi)的穩(wěn)定性,靶向于特定的組織/器官和潛在的非特異性(如脫靶作用和免疫反應(yīng))等。siRNA分子在體內(nèi)的穩(wěn)定性和特異性通過(guò)各種化學(xué)修飾已得到解決。雖然分子量大(～13KD)和強(qiáng)的負(fù)電荷是阻礙治療分子siRNA有效地在體內(nèi)發(fā)揮作用的最大障礙。但是目前各種對(duì)siRNA分子的修飾,包括將siRNA裝配進(jìn)陽(yáng)離子聚合物和脂質(zhì)體中形成納米粒、整合到外合體中、和各種肽(抗體或核酸結(jié)合區(qū)域)結(jié)合形成復(fù)合物,以及siRNA分子共軛連接于肽轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域、細(xì)胞特異性適體、受體特異性配體等這些措施有效地解決了這一難題,多種以RNAi為基礎(chǔ)的藥物也已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。 目前siRNA分子系統(tǒng)體內(nèi)應(yīng)用的最關(guān)鍵問(wèn)題是設(shè)計(jì)制備合適的給藥系統(tǒng),突破細(xì)胞膜障礙,提高轉(zhuǎn)染效率,靶向進(jìn)入深層組織和細(xì)胞,使siRNA分子更像一種藥物分子,選擇合適的給藥系統(tǒng)是臨床應(yīng)用siRNA分子的最大瓶頸。因此,為了臨床疾病的治療目的,需要大力研制能靶向性進(jìn)入組織和器官的siRNA給藥系統(tǒng),以改善siRNA分子的靶向性,提高轉(zhuǎn)染效率,發(fā)揮最大的療效和減少副作用。 整合素αvβ3在血管生成和腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用,而且在腫瘤血管和各種侵襲性腫瘤細(xì)胞中整合素αvβ3的表達(dá)都明顯升高,而在正常的靜止期內(nèi)皮細(xì)胞和組織中表達(dá)量較低,幾乎不表達(dá)。而大量研究發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關(guān)的整合素αvβ3和RGD肽具有高度的親和能力。且RGD修飾的納米�；虻鞍椎鹊榷伎梢赃x擇性進(jìn)入高表達(dá)αvβ3的細(xì)胞或組織。 在腫瘤形成早期由于腫瘤組織低氧環(huán)境、癌基因激活以及代謝性應(yīng)激的誘導(dǎo),使得成熟血管休眠期被打破,促血管新生因子表達(dá)上調(diào),發(fā)生血管新生。血管新生不僅在生長(zhǎng)、繁殖、修復(fù)等過(guò)程中起著重要的作用,同時(shí)也對(duì)腫瘤形成、轉(zhuǎn)移及其它許多非腫瘤疾病起決定性作用。如果沒(méi)有血管的營(yíng)養(yǎng)、血液以及氧的供給,腫瘤只能生長(zhǎng)1-2mm,因而抑制血管新生為抑制腫瘤的關(guān)鍵,抑制血管新生相關(guān)信號(hào)通路為抗腫瘤熱門靶點(diǎn)。VEGF/VEGFR2通路在腫瘤血管新生中起關(guān)鍵作用,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGFs)和其相關(guān)的受體(VEGFRs)參與調(diào)節(jié)早期胚胎發(fā)育中前體細(xì)胞中的血管發(fā)育,到后期預(yù)先存在的血管中新生血管的形成。在實(shí)體瘤中,VEGF主要由腫瘤細(xì)胞生成,VEGF和VEGFR2結(jié)合進(jìn)一步激活腫瘤血管多種重要的細(xì)胞通路。因此,有效地抑制腫瘤血管的生成,可抑制腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。利用siRNA分子抑制VEGFR2的表達(dá),可以達(dá)到治療腫瘤的口的。 本研究中,我們研制了一種具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、能容易產(chǎn)業(yè)化的靶向腫瘤新生血管及腫瘤細(xì)胞的siRNA給藥系統(tǒng)：cRGD-siRNA分子；經(jīng)血管途徑給藥后可介導(dǎo)各種siRNA分子進(jìn)入腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞及多種腫瘤細(xì)胞,沉默靶基因的表達(dá),發(fā)揮siRNA分子的生物學(xué)功能。 目的 1.合成cRGD-siRNA分子并且對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。 2.體外研究cRGD-siRNA分子的細(xì)胞靶向性,細(xì)胞毒性以及基因沉默功能。 3.研究cRGD-siRNA分子抑制斑馬魚的血管生成作用。 4.體內(nèi)腫瘤組織靶向性研究：經(jīng)血管途徑給藥后不同時(shí)間,cRGD-siRNA分子在腫瘤裸鼠體內(nèi)的腫瘤靶向性以及在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布。 5.cRGD-siRNA分子的抑瘤生物學(xué)功能及其機(jī)制研究：研究系統(tǒng)途徑連續(xù)給予cRGD-siRNA分子的抗腫瘤生長(zhǎng)的生物學(xué)功能,及其機(jī)制(血管生成抑制、基因沉默、腫瘤細(xì)胞凋亡)；同時(shí)通過(guò)ELISA和血液化學(xué)檢測(cè)體內(nèi)給予cRGD-siRNA分子后的免疫刺激和毒副作用。 方法 1.制備cRGD-siRNA分子 用環(huán)狀cRGD肽通過(guò)巰基與siRNA分子正義鏈的3’端共軛連接,用高效液相色譜(HPLC)對(duì)純化后的cRGD-siRNA分子進(jìn)行測(cè)定,cRGD-sense siRNA分子的分子量通過(guò)質(zhì)譜分析進(jìn)行測(cè)定。同時(shí),選擇陰性對(duì)照肽cRAD通過(guò)巰基與siRNA分子正義鏈的3’端共軛連接,得到cRAD-siRNA分子作為陰性對(duì)照分子。 2.cRGD-siRNA分子體外功能研究 采用CCK-8檢測(cè)方法評(píng)價(jià)cRGD-siRNA分子的體外細(xì)胞毒性。通過(guò)共聚焦顯微鏡檢測(cè)Cy5標(biāo)記siRNA分子在細(xì)胞中的分布,來(lái)驗(yàn)證cRGD-siRNA分子靶向性進(jìn)入整合素αvβ3表達(dá)細(xì)胞的能力。采用RT-qPCR和western blot分別從mRNA和蛋白水平評(píng)價(jià)cRGD-siRNA分子在細(xì)胞中的基因沉默功能。用One Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；根據(jù)方差是否齊性選擇LSD或者Dunnett T3檢驗(yàn),比較各組之間差異顯著性 3. cRGD-siRNA分子抑制斑馬魚血管生成的研究 本研究選用野生型斑馬魚和flk1-GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚做為模型生物。在顯微鏡下挑選發(fā)育良好的斑馬魚胚胎(5hpf),放入6孔板中,每孔20個(gè)。通過(guò)顯微注射將cRGD-siRNA (zVEGFR2,100μM,2nl), zVEGFR2(100u M,2nl), cRGD(2mg/ml,2nl)或ddH20(2nl)注射進(jìn)5hpf的斑馬魚胚胎。然后置于28.5℃孵育,至24hpf和72hpf,分別采用熒光倒置顯微鏡和共聚焦顯微鏡檢測(cè)血管發(fā)育狀況。采用相對(duì)熒光密度對(duì)cRGD-siRNA給藥后在斑馬魚體內(nèi)對(duì)血管抑制情況進(jìn)行定量。以Adobe Photoshop7.0軟件記錄多層掃描投射熒光集合(Z-stack Projection)。以灰度平均值記為熒光亮度,結(jié)果以各組熒光亮度與對(duì)照組之比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。相對(duì)熒光密度以ddH20處理組進(jìn)行標(biāo)化。 4.系統(tǒng)給藥后cRGD-siRNA分子在體內(nèi)的腫瘤靶向性及分布研究。 cRGD-siRNA分子和裸siRNA分子經(jīng)尾靜脈給藥后,通過(guò)小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)IVIS Spectrum (Xenogen)檢測(cè)在腫瘤裸鼠體內(nèi)的分布。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約40-60mmm3時(shí),首先用底物D-Luciferin對(duì)腫瘤(A549-1uc+細(xì)胞,表達(dá)luciferase)進(jìn)行定位,然后給予lnmol Cy5標(biāo)記cRGD-siRNA分子和Cy5標(biāo)記的裸siRNA分子,接著采用小動(dòng)物活體成像儀檢測(cè)30min到24h中不同時(shí)間點(diǎn),Cy5標(biāo)記cRGD-siRNA分子和裸siRNA分子在腫瘤裸鼠中的分布。24h后,處死小鼠,取出腫瘤以及各個(gè)器官進(jìn)行成像。同時(shí)采用Cy5標(biāo)記cRAD-siRNA分子作陰性對(duì)照。 5.cRGD-siRNA分子的抑瘤生物學(xué)功能及其機(jī)制研究。 對(duì)裸鼠皮下接種5×106個(gè)A549一luc+人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞以建立腫瘤模型,每隔三天測(cè)量小鼠體重及腫瘤體積。腫瘤體積以游標(biāo)卡尺測(cè)量,計(jì)算公式為1/2×a×b2,其中a代表長(zhǎng)直徑,b代表短直徑。待腫瘤長(zhǎng)至40-60mm3,將荷瘤小鼠隨機(jī)分組。每組小鼠尾分別靜脈注射給予1nM cRGD-siRNAl (~0.753mg/kg; n=8),1nM cRGD-siRNA2(~0.753mg/kg; n=5),1nM cRAD-siRNA2(~0.753mg/kg; n=5), cRGD alone (~0.045mg/kg; n=5),1nM cRGD-si β-actin (~0.753mg/kg; n=5), cRGD-control siRNA (~0.753mg/kg; n=5)或生理鹽水(n=10),終體積為150μL。每隔兩天給予一次,共6次。腫瘤體積在每次給藥前進(jìn)行測(cè)定�；蛟谔囟ǖ臅r(shí)間點(diǎn),通過(guò)小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)IVIS Spectrum (Xenogen)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。應(yīng)用單因素重復(fù)測(cè)量方差分析比較給藥各組腫瘤體積是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線和熒光表達(dá)曲線比較各組腫瘤生長(zhǎng)是否存在差異。最后一次給藥后48h,進(jìn)行水合氯醛麻醉,眼球采血和剝離腫瘤組織,對(duì)腫瘤組織拍照后立即投入液氮以備RNA及蛋白提取分析。分離血清,通過(guò)ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-α,IFN-γ,IL-6和IL-12的表達(dá)量。全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)血清中ALT和Cr含量。免疫組化檢測(cè)腫瘤組織切片中CD31的表達(dá)量。TUNEL檢測(cè)腫瘤組織切片中細(xì)胞凋亡。用ANOVA對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果 1.鑒定制備的cRGD-siRNA分子 本課題制備并鑒定獲得了cRGD-siRNAl(小鼠VEGFR2)、cRGD-siRNA2(小鼠VEGFR2)、cRAD-siRNA(小鼠VEGFR2)、cRGD-control siRNA(隨機(jī)設(shè)計(jì)供對(duì)照)、cRGD-siRNAl (人VEGFR2)、cRGD-siRNA2(人VEGFR2)、cRAD-siRNA2(人VEGFR2)。典型cRGD-siRNA分子的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1-1A所示。HPLC測(cè)定純化后cRGD-siRNA分子的含量高于90%,質(zhì)譜測(cè)定cRGD-siRNA分子正義鏈的分子量為7975.3與預(yù)測(cè)的分子量7977.9相一致。20%SDS-PAGE凝膠電泳后,用花青染料SYBR Gold染色,結(jié)果顯示cRGD-siRNA分子與裸siRNA分子相比有遲滯現(xiàn)象。 2.cRGD-siRNA分子體外功能 (1)在37℃孵育24h后,經(jīng)過(guò)cRGD-siRNA和control siRNA(cRGD-NC-siRNA)處理后的細(xì)胞生長(zhǎng)率分別為96.5%和96.0%,而陽(yáng)性對(duì)照(Lipofectamine2000)/siRNA復(fù)合物為75.2%(P=0.000)。 (2)共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示在HUVEC細(xì)胞中存在大量Cy5標(biāo)記的cRGD-siRNA分子,而在整合度αvβ3特異性抗體和cRGD肽封閉后轉(zhuǎn)染的HUVEC細(xì)胞中無(wú)Cy5標(biāo)記的cRGD-siRNA分子。cRAD肽封閉后轉(zhuǎn)染的HUVEC細(xì)胞中也存在大量Cy5標(biāo)記的cRGD-siRNA分子。但Cy5標(biāo)記的cRAD-siRNA分子卻不能進(jìn)入HUVEC細(xì)胞中。 (3) qPCR結(jié)果顯示經(jīng)cRGD-siRNA1及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的siRNAl分子沉默靶基因分別為80%及75%,二者間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.022);Western blot研究表明,二者抑制靶蛋白分別為80%及70%,二者間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.522)。cRGD-siRNA2分子沉默靶基因?yàn)?6%,與對(duì)照組相比有顯著差異(P=0.000);cRGD-siRNA2分子沉默靶蛋白為75%,與對(duì)照組相比有顯著差異(P=0.009)。 3.cRGD-siRNA分子可抑制斑馬魚血管的發(fā)育。 通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)了cRGD-siRNA VEGFR2分子對(duì)斑馬魚軀干部血管的影響。選擇觀察這一區(qū)域,是因?yàn)橄啾阮^面部血管,軀干部血管比較簡(jiǎn)單和規(guī)則,對(duì)這些血管的研究也比較透徹。斑馬魚胚胎中αv β3受體在48hpf開(kāi)始表達(dá),而斑馬魚胚胎發(fā)育中主要的血管,包括DA和腹側(cè)靜脈血管在24hpf完全發(fā)育。而新生血管主要在24hpf和72hpf之間發(fā)育。因此我們選擇24h和72作為觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)。在給藥處理后24hpf,通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)cRGD-siRNA和siVEGFR2處理組軀干血管發(fā)育受到抑制,但沒(méi)有明顯的差異。然而在72hpf,與ddH20處理組相比,cRGD-siRNA組斑馬魚的新生血管發(fā)育明顯受到抑制,而且相對(duì)熒光強(qiáng)度的表達(dá)量約為48.8%,有顯著差異(P=0.000)。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)因血管異常發(fā)育而導(dǎo)致畸形斑馬魚,及死亡的斑馬魚。 4.系統(tǒng)給藥后cRGD-siRNA分子在體內(nèi)的腫瘤靶向性及分布 經(jīng)尾靜脈給予熒光標(biāo)記(Cy5)cRGD-siRNA分子后30min到24h內(nèi),通過(guò)小動(dòng)物活體成像儀檢測(cè)均可發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中的熒光分布；而經(jīng)尾靜脈同樣給予Cy5標(biāo)記的裸siRNA分子組在腫瘤部位未檢測(cè)到熒光,主要存在于腎臟和肝臟。解剖后裸鼠的各個(gè)器官和腫瘤組織成像后的結(jié)果和活體成像的結(jié)果相一致。Cy5標(biāo)記的cRAD-siRNA分子組在腫瘤部位也未檢測(cè)到熒光,主要存在于腎臟和肝臟。 5.cRGD-siRNA分子的抑瘤生物學(xué)功能及其作用機(jī)制 每隔兩天經(jīng)尾靜脈給予荷瘤小鼠一次cRGD-siRNAl(小鼠VEGFR2),共6次。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定腫瘤的體積和腫瘤內(nèi)熒光強(qiáng)度。最后一次給藥后48h,處死小鼠,并取出腫瘤組織。進(jìn)行RT-qPCR和western blot測(cè)定VEGFR2的mRNA和蛋白的表達(dá)量,表達(dá)量分別為均49.1%和42.2%,均存在顯著差異(P=0.000和P=0.000)。VEGFR2的降低,反過(guò)來(lái)導(dǎo)致腫瘤的生長(zhǎng)受到抑制(P=0.000),而腫瘤的熒光信號(hào)強(qiáng)度降低90%, P=0.000。同時(shí),cRGD-siRNA2(小鼠VEGFR2)也有相似的藥理學(xué)作用：mRNA水平的表達(dá)降低約45%,有顯著差異(P=0.000),蛋白水平的表達(dá)降低65%,有顯著差異(P=0.000),以及腫瘤體積的顯著減小(P=0.000)和腫瘤內(nèi)熒光強(qiáng)度的減弱約70%,P=0.005。不同序列的siRNA分子的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了沉默效能的序列特異性。TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示了cRGD-siRNA組腫瘤細(xì)胞凋亡的數(shù)量明顯高于對(duì)照組cRAD-siRNA和生理鹽水。而免疫組化分析的結(jié)果顯示：與對(duì)照組cRAD-siRNA和生理鹽水相比,由于VEGFR2的表達(dá)降低,cRGD-siRNA組中CD31的密度也明顯降低。而在給藥后6h和24h,和對(duì)照組相比,cRGD-siRNA組細(xì)胞因子IFN-α,IFN-γ, IL-6和IL-12,均沒(méi)有表達(dá)量明顯升高的差異。此外,與對(duì)照組相比,cRGD-siRNA組中肌酐和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P=0.890和P=0.930。在cRGD-siRNA組和其他組中經(jīng)過(guò)16天的治療,并無(wú)死亡和體重降低的情況發(fā)生。 結(jié)論： 1.環(huán)狀RGD寡肽及對(duì)照RAD寡肽通過(guò)linker巰基-馬來(lái)酰胺與siRNA分子正義鏈的3’端相連,經(jīng)電泳及核磁鑒定成功合成了cRGD-siRNA分子。 2.cRGD-siRNA分子沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性。 3.cRGD-siRNA分子可以特異性進(jìn)入表達(dá)整合素αvβ3的細(xì)胞中,提示該分子可經(jīng)受體介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞；并有效沉默靶基因的表達(dá),與脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞攝入siRNA分子的沉默效率沒(méi)有差異。 4.cRGD-siRNA分子(靶向斑馬魚VEGFR2)可能通過(guò)整合素αvβ3受體介導(dǎo),可以有效地抑制斑馬魚胚胎新生血管生成。 5. cRGD寡肽修飾的siRNA分子(cRGD-siRNA)經(jīng)小鼠尾靜脈給藥后,可靶向性分布于腫瘤部位,進(jìn)入新生血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi),并介導(dǎo)靶基因的沉默。 6.cRGD-siRNA(小鼠VEGFR2)可抑制腫瘤的生長(zhǎng),且該生物學(xué)活性是通過(guò)沉默腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)(VEGFR2)、抑制抗腫瘤部位新生血管的生成、及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。 7.實(shí)驗(yàn)期間體內(nèi)應(yīng)用cRGD-siRNA分子無(wú)免疫刺激、無(wú)明顯的肝腎毒性,具有良好的耐受性。 8.cRGD-siRNA分子具有臨床治療腫瘤的應(yīng)用前景。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R73-36

【參考文獻(xiàn)】

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1 郎楠;劉明;唐秋琳;;microRNA-29s對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用(英文)[J];癌癥;2010年06期

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本文編號(hào)：1604185