本文關(guān)鍵詞： 釀酒酵母 木質(zhì)纖維素 燃料乙醇 進(jìn)化工程 木糖異構(gòu)酶 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白　出處：《山東大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：當(dāng)前,開發(fā)利用可再生能源已成為世界各國保障能源安全、加強(qiáng)環(huán)境保護(hù)、應(yīng)對(duì)氣候變化的重要措施�？稍偕茉词悄茉大w系的重要組成部分,具有資源分布廣、開發(fā)潛力大、環(huán)境影響小、可永續(xù)利用的特點(diǎn),是有利于人與自然和諧發(fā)展的能源資源。隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展,我國能源需求持續(xù)增長,能源資源和環(huán)境問題日益突出,加快開發(fā)利用可再生能源是我國應(yīng)對(duì)日益嚴(yán)峻的能源環(huán)境問題的必由之路也是實(shí)現(xiàn)能源可持續(xù)發(fā)展的必然選擇。生物燃料乙醇,由于其獨(dú)特的車用屬性,是公認(rèn)的很有發(fā)展前景的可再生生物能源之一。包括美國、巴西及歐盟在內(nèi)的許多國家和地區(qū)都在大力發(fā)展生物燃料乙醇產(chǎn)業(yè),我國也在《可再生能源中長期發(fā)展規(guī)劃》及《可再生能源發(fā)展“十二五”規(guī)劃》中將生物燃料乙醇列為重點(diǎn)發(fā)展及支持領(lǐng)域。由于我國可耕地面積少,以玉米、小麥、木薯、紅薯等糧食及非糧淀粉為原料的第1、1.5代燃料乙醇生產(chǎn)不可避免地存在“與人爭(zhēng)糧”“與糧爭(zhēng)地”的問題,均不能大規(guī)模發(fā)展,政府對(duì)此進(jìn)行了生產(chǎn)規(guī)模的限制。而以儲(chǔ)量豐富廉價(jià)的可再生木質(zhì)纖維素生物質(zhì)為原料的第二代燃料乙醇生產(chǎn)被認(rèn)為是可持續(xù)發(fā)展燃料乙醇的必然選擇。以木質(zhì)纖維素生物質(zhì)為原料的二代燃料乙醇的生產(chǎn)包括原料的預(yù)處理,酶解釋放可發(fā)酵性單糖以及微生物的乙醇發(fā)酵等步驟,各步驟均面臨諸多困難且導(dǎo)致了乙醇生產(chǎn)成本的增加,不利于其與傳統(tǒng)化石能源的競(jìng)爭(zhēng)及大規(guī)模開發(fā)利用。其中實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)原料中的全糖(主要是葡萄糖及木糖)乙醇發(fā)酵是提高原料利用率降低生產(chǎn)成本的關(guān)鍵點(diǎn)之一。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是傳統(tǒng)的乙醇生產(chǎn)菌株,其具有較高的己糖發(fā)酵乙醇得率,且對(duì)多種工業(yè)條件下的抑制因素包括滲透壓、乙醇等均具有較高的耐受性,因此也是二代燃料乙醇生產(chǎn)首選發(fā)酵微生物。但是,當(dāng)發(fā)酵底物由淀粉類原料變?yōu)槟举|(zhì)纖維素生物質(zhì)為原料時(shí)候,釀酒酵母需要解決兩方面的難題:首先,天然釀酒酵母不能很好的代謝木糖,而木糖是木質(zhì)纖維素原料中含量僅次于葡萄糖的單糖,對(duì)其有效的利用和發(fā)酵可以降低二代燃料乙醇的生產(chǎn)成本以提高其經(jīng)濟(jì)競(jìng)爭(zhēng)力;另外,木質(zhì)纖維素原料在預(yù)處理及酶解過程中,伴隨著可發(fā)酵性糖的生成,也產(chǎn)生了大量的對(duì)微生物生長及發(fā)酵有抑制性作用的化合物,例如弱酸類、呋喃醛類及酚類化合物,這些化合物的存在抑制了釀酒酵母的生長及后續(xù)的乙醇發(fā)酵,延長發(fā)酵時(shí)間及降低了乙醇的生成速率,雖然可以利用生物、物理或化學(xué)方法對(duì)預(yù)處理原料進(jìn)行脫毒處理,但這無疑增加了乙醇生產(chǎn)過程的復(fù)雜性及成本,同時(shí)也導(dǎo)致了可發(fā)酵性糖的損失,因此增加釀酒酵母自身對(duì)發(fā)酵過程中抑制物的耐受性從而提高乙醇的生成速率是解決這一問題的關(guān)鍵。所以,獲得一株能高效共發(fā)酵葡萄糖和木糖同時(shí)也具有較高耐受性的釀酒酵母是第二代燃料乙醇的經(jīng)濟(jì)有效生產(chǎn)的前提和必要條件。為此,開展適于木質(zhì)纖維素原料產(chǎn)業(yè)化乙醇生產(chǎn)釀酒酵母菌株的代謝工程改造的研究,主要工作包括:1、綜合評(píng)價(jià)篩選適合二代燃料乙醇生產(chǎn)代謝工程改造的釀酒酵母受體菌株適宜本底遺傳特性是構(gòu)建優(yōu)良的葡萄糖/木糖共發(fā)酵重組釀酒酵母菌株的前提。本文對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的32株野生型釀酒酵母,在分析其遺傳倍性的基礎(chǔ)上,進(jìn)行多指標(biāo)綜合評(píng)估篩選:葡萄糖發(fā)酵乙醇得率、對(duì)多種抑制因子(高溫、高滲透壓力、氧化性脅迫、糠醛、乙酸、香草醛、乙醇等)耐受性的單因素檢測(cè);對(duì)混合有多種毒性化合物玉米秸稈預(yù)處理水解液的耐受性;通過在釀酒酵母染色體上整合初始木糖代謝途徑,測(cè)定對(duì)木糖的本底利用能力。在所有評(píng)價(jià)的菌株中,分離于熱帶水果的二倍體野生型釀酒酵母菌株BSIF具有最高的葡萄糖發(fā)酵乙醇得率(限氧搖瓶發(fā)酵中,乙醇得率為0.451g g-1消耗葡萄糖);對(duì)多種單一抑制因素(高溫、高滲透壓、氧化性脅迫)及玉米秸稈預(yù)處理水解液具有較高耐受性;同時(shí)具有較好的本底代謝木糖產(chǎn)乙醇的能力。為此選擇菌株BSIF作為代謝工程改造的受體菌株。2、理性代謝工程改造賦予野生型釀酒酵母木糖代謝能力野生型釀酒酵母菌株由于自身代謝木糖相關(guān)酶的活性不足,不能或僅少量非特異性利用木糖,但能代謝其異構(gòu)體木酮糖。為此,根據(jù)代謝工程原理在篩選出的二倍體野生型釀酒酵母菌株BSIF中建立木糖代謝途徑。木糖異構(gòu)酶(xylose isomerase,XI)是自然界轉(zhuǎn)化木糖到木酮糖的有效代謝途徑,通過二輪定位整合方式,在二倍體菌株BSIF染色體的PHO13基因座位上插入具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的、克隆自牛瘤胃液宏基因組的木糖異構(gòu)酶基因Ru-xylA (GenBank JF496707)三個(gè)串聯(lián)的基因表達(dá)框,以實(shí)現(xiàn)木糖異構(gòu)酶的異源表達(dá),同時(shí)破壞了 PH013基因,減少無效循環(huán)導(dǎo)致ATP的浪費(fèi),基因型pho13::XI。繼而為了強(qiáng)化自身下游代謝途徑,在GRE3基因座位插入含有磷酸戊糖途徑(PPP)非氧化部分的四個(gè)基因獨(dú)立表達(dá)框,在超表達(dá)PPP途徑的同時(shí),使GRE3基因失活以減少副產(chǎn)物木糖醇的產(chǎn)生,基因型pho13::XI,gre3::PPP。木酮糖激酶是木糖代謝進(jìn)入PPP途徑的關(guān)鍵酶,該酶基因XKS1的適度超表達(dá)以增強(qiáng)下游代謝通量的同時(shí),又不至于過度消耗ATP,為此通過在染色體上替換組成型強(qiáng)啟動(dòng)子TEF1p的策略來達(dá)到這一目的,基因型pho13::XI;gre3::PPP,XK。由于木糖異構(gòu)酶催化的異構(gòu)反應(yīng)是釀酒酵母胞內(nèi)木糖代謝的第一步,為了繼續(xù)提高其酶活,進(jìn)一步選用染色體重復(fù)序列的8-sequence座位進(jìn)行三輪整合Ru-xylA基因表達(dá)框以提高其基因拷貝數(shù),得到菌株BSN3 (pho13::XI,3δ::XI,gre3::PPP, XK)。對(duì)理性改造過程衍生出的各個(gè)菌株的基本性能測(cè)試列于下表,結(jié)果表明,己在二倍體野生型釀酒酵母菌株中建立了木糖代謝途徑,且各種措施均有利于提高木糖代謝能力,而木糖異構(gòu)酶的高活性更為關(guān)鍵。對(duì)混合糖(20 gL-1葡萄糖,20 gL-1木糖)的發(fā)酵,菌株BSN3在72h的木糖消耗量為18.22±0.24gL-1,且乙醇產(chǎn)生量也最高,為14.65g L-1。Table.理性代謝工程改造衍生菌株的特性3、非理性進(jìn)化工程增強(qiáng)釀酒酵母木糖代謝能力通過理性代謝工程改造賦予了二倍體野生型釀酒酵母菌株BSIF木糖利用的能力,但得到的代謝工程菌株BSN3的木糖利用能力還有限。一般地,細(xì)胞內(nèi)一些未知因素也會(huì)影響木糖到乙醇的轉(zhuǎn)化率,為此繼續(xù)對(duì)BSN3進(jìn)行非理性進(jìn)化工程改造。在木糖(20 g L-1)為唯一碳源的培養(yǎng)基中進(jìn)行馴化培養(yǎng),以細(xì)胞生物量倍增為轉(zhuǎn)接指標(biāo),隨著轉(zhuǎn)接次數(shù)的增加,細(xì)胞在木糖培養(yǎng)基上生長逐漸好轉(zhuǎn),生物量倍增時(shí)間縮短,經(jīng)過連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng),生物量倍增時(shí)間穩(wěn)定在大約120 min時(shí),對(duì)培養(yǎng)液涂布平板分離單菌落,挑取近20個(gè)單菌落,在木糖(20 gL-1)為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中測(cè)定比較最大比生長速率μmax,選擇出生長最快的單菌落XH7 (pho13::XI,3δ::XI,gre3::PPP,XK, AE),用于開展下一步的菌株改造研究,結(jié)果表明,細(xì)胞在木糖上的長期馴化提高了木糖異構(gòu)酶活性及木糖代謝能力,XH7的木糖異構(gòu)酶比酶活提高至0.669±0.009 U mg-1 protein。同時(shí)在發(fā)酵罐限氧條件下,對(duì)木糖(40 gL-1)及混合糖(80g L-1葡萄糖,40g L-1木糖)的發(fā)酵,分別于26 h與40 h耗盡全部40 g L-1木糖,且具有較高乙醇得率。木糖代謝能力相比BSN3明顯提高。4、非理性進(jìn)化工程增強(qiáng)釀酒酵母抗逆能力在預(yù)處理玉米秸稈水解液中發(fā)酵,底物中抑制物及寡營養(yǎng)氮源對(duì)酵母發(fā)酵存在不利影響,雖然接種量的增加可以很大程度上彌補(bǔ)這種不利影響,但是從生產(chǎn)成本及競(jìng)爭(zhēng)力方面考慮,依然需要酵母自身具有高抑制物耐受性。同時(shí)考慮到水解液中抑制物組分及其相互作用的復(fù)雜性以及酵母對(duì)其耐受性機(jī)制了解的不夠透徹,因而以含有復(fù)合毒性化合物的玉米秸稈預(yù)處理瀝出液作為馴化培養(yǎng)基,對(duì)XH7進(jìn)一步馴化以提高細(xì)胞對(duì)水解液中抑制物的耐受性。以細(xì)胞生物量倍增為轉(zhuǎn)接指標(biāo),經(jīng)過約900小時(shí)的轉(zhuǎn)接馴化培養(yǎng),細(xì)胞生物量倍增時(shí)間從7h降至并維持在3.9h時(shí),對(duì)培養(yǎng)液涂布平板分離單菌落,挑取近100個(gè)單菌落,利用BioScreen system (Oy Growth Curves Ab Ltd, Helsinki, Finland)對(duì)選取的單菌落的生長進(jìn)行測(cè)定并選擇比生長速率最大的菌落,命名為XHR11 (pho13::XI,3δ::XI,gre3::PPP,XK,AE-PCS)。對(duì)玉米秸稈預(yù)處理酶解液發(fā)酵結(jié)果表明,相比菌株XH7,XHR11對(duì)玉米秸稈水解液的耐受性明顯提高,生物量提高了 3倍,且多消耗11.96 gL-1木糖,乙醇得率提高了 21.5 %。5、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白提高葡萄糖木糖共發(fā)酵能力糖轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)是釀酒酵母糖代謝的第一步,重組釀酒酵母對(duì)木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)是通過自身葡萄糖運(yùn)輸?shù)鞍追翘禺愋缘赝瓿?不僅效率低且受葡萄糖的抑制,影響木糖利用效率。而在釀酒酵母中表達(dá)異源高效戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,有利于提高戊糖的攝取效率,促進(jìn)戊糖代謝能力。季也蒙酵母Mguilliermondii ATCC 6260的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Mgt05196p的突變子N360S,是具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的、在釀酒酵母中能高效轉(zhuǎn)運(yùn)木糖的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。為此,在菌株XHR11染色體上整合異源糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變子N360S。由于受體菌株BSIF本底利用木糖的能力較強(qiáng),測(cè)試結(jié)果表明轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白N360S對(duì)重組菌株的木糖代謝能力沒有明顯的促進(jìn)作用。但經(jīng)過木糖(20 g L-1)為唯一碳源的培養(yǎng)基中短時(shí)馴化后,細(xì)胞生物量倍增時(shí)間進(jìn)一步縮短,而同時(shí)對(duì)XHR11菌株的馴化,細(xì)胞生物量倍增時(shí)間沒有變化。單菌落分離且進(jìn)行性能比較后,得到菌株 LF1 (pho13:XI, 3δ::XI,gre3::PPP,XK, AE-PCS,N360S,AE)。菌株LF1發(fā)酵木糖(40 g L-1),12 h內(nèi)耗盡全部木糖,發(fā)酵混合糖(80 g L-1葡萄糖和40 gL-1木糖),16 h耗盡全部糖分。菌株LF1對(duì)木糖發(fā)酵能力超過目前報(bào)道的最好水平。6、木質(zhì)纖維素原料燃料乙醇生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化推進(jìn)收集各公司實(shí)際研發(fā)中用的不同木質(zhì)纖維素原料的預(yù)處理水解液,這些原料的種類不同,預(yù)處理方式不同,因而釋放的糖分及毒性成分與含量也不同。以這些產(chǎn)業(yè)化原料的乙醇發(fā)酵結(jié)果顯示,在不同原料中,菌株LF1比XHR11利用木糖能力均有明顯的提高。在山東泉林集團(tuán)提供的水解液樣本中,菌株LF1在20 h耗盡水解液中全部糖分(約40 g L-1 ),糖醇轉(zhuǎn)化率為0.480,達(dá)到理論值的94.1 %。菌株LF1已具備木質(zhì)纖維素原料燃料乙醇實(shí)際產(chǎn)業(yè)化潛力,但與各公司的實(shí)際不同上游預(yù)處理、酶解工藝路線的適配集成,仍需要進(jìn)一步研究。
[Abstract]:The development and utilization of renewable energy has become one of the key points in the sustainable development of energy resources . A new type of Saccharomyces cerevisiae strain , which is suitable for producing Saccharomyces cerevisiae strain with high tolerance to ethanol production by ethanol production of lignocellulose raw material , has been studied by integrating initial xylose metabolism pathway on chromosome of Saccharomyces cerevisiae . In order to improve the activity of xylose isomerase catalyzed by xylose isomerase was the first step in the metabolism of xylose in Saccharomyces cerevisiae . The results showed that the growth rate of xylose isomerase was 18 . 22 鹵 0 . 24 g L - 1 and the yield of xylose isomerase was 18 . 22 鹵 0 . 24 g L - 1 . The fermentation of xylose ( 40 g L - 1 ) and mixed sugar ( 80 g L - 1 glucose , 40 g L - 1 xylose ) was carried out at 26 h and 40 h respectively . The results of fermentation of maize straw pretreatment showed that compared with the strain XH7 , XHR11 increased the tolerance of corn stalk hydrolysate , increased the biomass by 3 times , increased the yield of xylose by 21.5 % . Strain LF1 was used to ferment xylose ( 40 g L - 1 ) , all xylose was depleted in 12 hours , and the mixture sugar ( 80 g L - 1 glucose and 40 g L - 1 xylose ) was used to ferment and mix sugar ( 80 g L - 1 glucose and 40 g L - 1 xylose ) . The strain LF1 has the actual industrial potential of lignocellulose raw material fuel ethanol , but it still needs further research with the actual different upstream pretreatment and the adaptation integration of the enzymolysis technology route .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：TQ223.122;TQ920.6

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉向勇;張小華;鮑曉明;;釀酒酵母工業(yè)菌株脅迫條件耐受性分析[J];中國釀造;2006年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 汪城墻;釀酒酵母異源戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的篩選及功能研究，釀酒酵母L-阿拉伯糖代謝途徑的構(gòu)建與優(yōu)化[D];山東大學(xué);2014年

，

本文編號(hào)：1507427