本文關(guān)鍵詞：傳統(tǒng)藏藥材川西獐牙菜減輕肝臟膽汁淤積損傷的分子機(jī)制研究　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景及目的膽汁淤積(Cholestasis)是由多種肝臟疾病引起的臨床綜合癥,常與原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎、Dubin-Johnson綜合癥等相伴[1-3]。肝炎、藥物中毒、梗阻、妊娠等均可引起膽汁淤積。就分子水平而言,膽汁淤積的發(fā)生主要與位于肝細(xì)胞表面的膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MDR1(多藥耐藥蛋白1,Multidrug resistance protein 1)、MDR2(多藥耐藥蛋白2,Multidrug resistance protein 2)、MRP2(多要耐藥相關(guān)蛋白2,Multidrug resistance-associated protein 2)、MRP3(多藥耐藥相關(guān)蛋白3,Multidrug resistance-associated protein 3)、MRP4(多要耐藥相關(guān)蛋白4,Multidrug resistance-associated protein 4)等的表達(dá)異常相關(guān)。其中,MRP3、MRP4位于肝細(xì)胞基底側(cè)膜,主要負(fù)責(zé)將有機(jī)陰離子、膽紅素、藥物等由肝細(xì)胞排入血液,而MRP2、MDR1、MDR2等則位于肝細(xì)胞膽管膜面,主要將一些內(nèi)源性或外源性的結(jié)合產(chǎn)物排入膽管[4、5]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,膽汁淤積發(fā)生后,位于肝細(xì)胞膽管膜面的MRP2表達(dá)下降,而位于肝細(xì)胞基底側(cè)膜的MRP3、MRP4的表達(dá)則增高,以代償MRP2的部分功能[6]。目前,臨床治療膽汁淤積主要依靠FXR的激動(dòng)劑UDCA,但是UDCA并不適用于所有人群,此外,還有利福平、苯巴比妥等,但其都具有自身局限性,而正在開(kāi)發(fā)的新藥GW4064和TNT747目前還處于臨床試驗(yàn)階段。因此,臨床亟需研發(fā)新的更有效的藥物。川西獐牙菜為我國(guó)藏藥八寶——“藏茵陳”的主要原生植物之一,常年生長(zhǎng)于海拔2000-5000米的青藏高原,其主要有效成分為獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、齊墩果酸、芒果苷、苦龍膽苷、當(dāng)藥醇苷等,具有清肝利膽,祛熱退黃之功效,尤其適用于黃疸型肝炎、病毒性肝炎,是我國(guó)治療各種肝病的傳統(tǒng)藥材[7-9]。但其清肝利膽的具體分子機(jī)制并不明確,加之成分復(fù)雜多樣,因此難以被國(guó)際醫(yī)學(xué)界接受。臨床治療膽汁淤積的常用藥物“尤思弗”其主要成分為UDCA,即是從熊膽汁中提取出的有效成分,而我國(guó)古代便有使用熊膽汁治療各種肝病的傳統(tǒng)。受“尤思弗”發(fā)現(xiàn)、研究、推廣的啟發(fā),我們對(duì)治療各種肝病,具有“清肝利膽”作用的藏藥“藏茵陳”進(jìn)行研究,提取其主要原生植物——川西獐牙菜的醇提物,用以干預(yù)膽汁淤積的動(dòng)物模型,以期能夠發(fā)現(xiàn)新的治療膽汁淤積的有效藥物,彌補(bǔ)UCDA的不足,同時(shí)也為保護(hù)我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥,維護(hù)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)做出貢獻(xiàn)。研究方法1.建立膽道結(jié)扎的大鼠膽汁淤積模型,并對(duì)其進(jìn)行藥物干預(yù),膽汁淤積模型的建立見(jiàn)參考文獻(xiàn)[6]。將15只sd大鼠使用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組:(1)川西獐牙菜醇提物組、(2)udca組、(3)生理鹽水組,每組5只。分別用川西獐牙菜醇提物、udca、生理鹽水連續(xù)灌胃7d,7d后處死大鼠,收集血液、尿液及肝臟組織。血清學(xué)檢測(cè)肝損傷指標(biāo)和黃疸指標(biāo),he染色觀察肝臟損傷情況,以明確川西獐牙菜對(duì)膽道結(jié)扎的大鼠膽汁淤積模型是否具有保護(hù)作用。2.藥物干預(yù)正常大鼠:使用隨機(jī)數(shù)字表法將10只正常雄性sd大鼠分為2組:(1)川西獐牙菜醇提物組、(2)生理鹽水組,每組5只。分別用川西獐牙菜醇提物和生理鹽水連續(xù)灌胃7d,7d后處死大鼠收集肝臟組織。提取大鼠肝臟rna和總蛋白,分別在mrna水平和蛋白水平檢測(cè)肝細(xì)胞膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mrp3、mrp4、mrp2、mdr1、mdr2、ostα、ostβ的表達(dá)變化和核轉(zhuǎn)錄因子nrf2、lrh-1及核受體rxrα、rarα、vdr、pxr、car等的表達(dá)變化,最后分析其相關(guān)性,尋找川西獐牙菜醇提物對(duì)膽道結(jié)扎的大鼠膽汁淤積模型保護(hù)作用的可能分子機(jī)制。結(jié)果1.藥物干預(yù)膽道結(jié)扎的大鼠膽汁淤積模型:分別用100mg/kgbodyw.t.的川西獐牙菜醇提物、udca(陽(yáng)性對(duì)照)、生理鹽水(陰性對(duì)照)連續(xù)灌胃大鼠7d,收集標(biāo)本,血清學(xué)結(jié)果顯示:與生理鹽水組相比,川西獐牙菜組和udca組的肝損傷指標(biāo)和黃疸指標(biāo)明顯低于生理鹽水組,且川西獐牙菜組的各項(xiàng)指標(biāo)較udca組降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。h.e.染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)川西獐牙菜組大鼠肝臟損傷情況明顯輕于udca組和生理鹽水組。2.藥物干預(yù)正常大鼠:以生理鹽水為陰性對(duì)照,100mg/kgbodyw.t.的川西獐牙菜醇提物連續(xù)灌胃大鼠7d,收集大鼠肝臟組織標(biāo)本后提取rna和蛋白,利用rt-qpcr和westernblot技術(shù)分別檢測(cè)肝臟膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mrp2、mrp3、mrp4、mdr1、mdr2等和核受體pxr、rxrα、rarα、vdr以及核轉(zhuǎn)錄因子lrh-1、nrf2等的表達(dá)變化,結(jié)果顯示:(1)膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白:在mrna水平,與陰性對(duì)照組相較,mrp4、mrp3表達(dá)上升明顯,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示:mrp4的表達(dá)增高了2.1倍,mrp3的表達(dá)增高了1.7倍,結(jié)果顯著,具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在蛋白水平,川西獐牙菜組mrp4、mrp3表達(dá)亦增高,其中Mrp4表達(dá)增高2.5倍,Mrp3表達(dá)增高3.0倍,結(jié)果顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而Mdr1、Mdr2、Rxrα、Rarα、Vdr等無(wú)明顯變化。同時(shí),免疫熒光結(jié)果也顯示,川西獐牙菜醇提物組其樣本Mrp4、Mrp3的表達(dá)明顯強(qiáng)于陰性對(duì)照組。(2)核受體和核轉(zhuǎn)錄因子:在mRNA水平,相比于陰性對(duì)照組,川西獐牙菜醇提物組Nrf2表達(dá)增高1.8倍,Lrh-1表達(dá)增高1.4倍;同時(shí),在蛋白水平,與陰性對(duì)照組相比,川西獐牙菜醇提物組Nrf2表達(dá)增高2.3倍,Lrh-1表達(dá)增高1.3倍,Pxr表達(dá)增高1.8倍,Vdr表達(dá)增高1.8倍,結(jié)果顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與核受體和核轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)性分析:由于在mRNA水平和蛋白水平均發(fā)現(xiàn):相較于陰性對(duì)照組,川西獐牙菜醇提物組肝細(xì)胞表面膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Mrp4、Mrp3和核受體Lrh-1、核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的表達(dá)增高,通過(guò)線性回歸分析發(fā)現(xiàn):川西獐牙菜可能通過(guò)Nrf2刺激Mrp4使其表達(dá)增高,而與Mrp3無(wú)關(guān)。結(jié)論(1)與生理鹽水組相比,川西獐牙菜醇提物和UDCA均具有減輕肝損傷的作用,且川西獐牙菜醇提物的作用明顯強(qiáng)于UDCA組。(2)川西獐牙菜醇提物可能通過(guò)核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2調(diào)節(jié)Mrp4的表達(dá)上調(diào),從而發(fā)揮減輕膽汁淤積大鼠肝臟損傷的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R29

【參考文獻(xiàn)】

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1 杜曉煌;柴進(jìn);封欣嬋;張j君;程英;陳文生;方勇飛;;川西獐牙菜醇提物對(duì)大鼠膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Mrp4、轉(zhuǎn)錄因子Nrf2表達(dá)的影響[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2015年10期

2 張艷;刁治民;王健;楊予青;張靜;;藏茵陳藥用植物學(xué)特性及可持續(xù)利用[J];青海草業(yè);2007年01期

3 江莉;臧立華;劉廣華;向鳳寧;夏光敏;;川西獐牙菜甲醇提取物的氣相色譜-質(zhì)譜分析[J];山東大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版);2005年06期

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5 楊慧玲,劉建全;9種“藏茵陳”原植物中的7種有效化學(xué)成分研究[J];中草藥;2005年08期

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