本文關(guān)鍵詞：法醫(yī)學(xué)尸體組織中管家基因的穩(wěn)定性研究及影響因素分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的 在進(jìn)行基因表達(dá)研究之前，數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化策略顯得尤為重要。理想的內(nèi)參基因應(yīng)該容易檢測(cè)并且在細(xì)胞周期中保持穩(wěn)定表達(dá)。在不同死后經(jīng)過時(shí)間里獲取的法醫(yī)學(xué)尸體組織對(duì)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性提出了更高的要求。為了判斷通常使用的人體內(nèi)參照基因（管家基因）在不同的死后間隔時(shí)間內(nèi)的穩(wěn)定性，本課題組在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，以法醫(yī)學(xué)尸體組織中管家基因表達(dá)的穩(wěn)定性為主要研究目標(biāo)，收集不同死后間隔時(shí)間的尸體檢材（腦皮質(zhì)、脾組織、胸大�。�，并延長觀察時(shí)間，使用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)六種常用的管家基因HMBS、TFRC、B2M、GAPDH、HPRT1和OAZ1的Ct值，力求探究法醫(yī)學(xué)尸體組織中管家基因的穩(wěn)定性與完整性；并對(duì)rRNA各亞基（5s、5.8s、18s、28s）、非管家基因（HIF1A、TNF-a）進(jìn)行相對(duì)定量，試圖解決分子標(biāo)記物的選擇對(duì)RNA定量的影響；在此基礎(chǔ)上還初步研究了年齡對(duì)管家基因穩(wěn)定性的影響。 材料方法 研究對(duì)象：分別提取6例不同死后間隔時(shí)間的尸體上的三種組織（腦皮質(zhì)、脾組織和胸大�。⒏鶕�(jù)年齡段分為嬰幼兒組（0-3歲）和成人組（15-60歲），每組3例。尸檢即刻分別于大腦皮質(zhì)、脾組織、左側(cè)胸大肌處取1cm3大小組織塊（50mg），經(jīng)100mMCaCl2和PBS緩沖液清洗、RNAlater穩(wěn)定液處理后轉(zhuǎn)入-80度低溫冰箱保存?zhèn)溆�。另取適量（5g）組織放入裝有PBS緩沖液的廣口瓶并離體放置于人工氣候箱中（比照生前環(huán)境溫、濕度設(shè)定），依次按不同時(shí)間點(diǎn)（48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h、240h）取樣，并分裝于RNAlater穩(wěn)定液中低溫凍存。 試驗(yàn)方法：組織提取RNA；RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈；分別設(shè)計(jì)引物，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)6例尸體腦皮質(zhì)、胸大肌、脾組織中不同時(shí)間點(diǎn)的六種常用的管家基因HMBS、TFRC、B2M、GAPDH、HPRT1和OAZ1的Ct值及rRNA各亞基（5s、5.8s、18s、28s）與非管家基因（HIF1A、TNF-a）的Ct值。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多樣本均數(shù)比較采用方差分析，各組數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。 研究結(jié)果 1.6種管家基因在直到死后間隔時(shí)間第10天時(shí)，，仍可以被檢出。其中大腦皮質(zhì)中，除管家基因OAZ1各時(shí)間點(diǎn)Ct值差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余5種管家基因HMBS在PMI=10天時(shí)Ct值開始顯著增高，TFRC、B2M、GAPDH、HPRT1在PMI=9天時(shí)Ct值開始顯著增高；脾組織中，6種管家基因除B2M在PMI=10天時(shí)Ct值開始顯著增高，其余管家基因HMBS、TFRC、GAPDH、HPRT1、OAZ1在PMI=9天時(shí)Ct值即開始顯著增高；而胸大肌內(nèi)6種管家基因各時(shí)間點(diǎn)Ct值差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且Ct值上下波動(dòng)無規(guī)律性。 2.作為對(duì)照的2種非管家基因HIF1（低氧誘導(dǎo)因子，Hypoxia inducible factor1）、TNFα（腫瘤壞死因子α，Tumor necrosis factor α）盡管直到死后間隔時(shí)間第10天時(shí)仍可以被檢出，但其表達(dá)則無明顯的規(guī)律性可言，其中大腦皮質(zhì)中，TNFα和成人組HIF1A各時(shí)間點(diǎn)Ct值差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，嬰幼兒組HIF1A直到PMI=9天時(shí)Ct值顯著增高；脾組織中，TNFα各時(shí)間點(diǎn)Ct值差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HIF1A直到PMI=9天時(shí)Ct值顯著增高；胸大肌內(nèi)，TNFα和HIF1A各時(shí)間點(diǎn)Ct值差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且Ct值上下波動(dòng)無規(guī)律性。 3.4種rRNA亞基在直到死后間隔時(shí)間第10天時(shí)，仍可以被檢出。其中大腦皮質(zhì)中，4種rRNA亞基在PMI=10天時(shí)Ct值開始顯著增高；脾組織中，18s rRNA各時(shí)間點(diǎn)與第1時(shí)間點(diǎn)相比，Ct值差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但18s rRNA的Ct值先降低后增高，PMI=4天時(shí)是折點(diǎn)低值，因此PMI=9天、PMI=10天與PMI=4天相比，Ct值顯著增高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；5s rRNA在PMI=10天時(shí)Ct值開始顯著增高，5.8s、28s在PMI=9天時(shí)Ct值即開始顯著增高；而胸大肌內(nèi)，5s、5.8s、28s各時(shí)間點(diǎn)Ct值差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且Ct值上下波動(dòng)無規(guī)律性；18s rRNA的Ct值在PMI=2天時(shí)顯著降低，之后各時(shí)間點(diǎn)之間相比，Ct值差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.嬰幼兒組與成人組相比，管家基因的表達(dá)存在明顯差異，但年齡差異與死后經(jīng)過時(shí)間無交互作用。成人組內(nèi)年齡差異是否會(huì)影響PMI推斷尚需驗(yàn)證。 5.腦皮質(zhì)、脾組織中管家基因的穩(wěn)定性可保持死后經(jīng)過時(shí)間9天以上，胸大肌中管家基因死后10天內(nèi)仍然保持穩(wěn)定，但管家基因表達(dá)波動(dòng)無規(guī)律，無明顯時(shí)間相關(guān)性。 研究結(jié)論 1.法醫(yī)學(xué)尸體組織中管家基因的穩(wěn)定性較好，可在PMI9-10天內(nèi)保持穩(wěn)定，其穩(wěn)定性足以應(yīng)用于推斷晚期死后經(jīng)過時(shí)間的研究。管家基因的組織差異性明顯，腦皮質(zhì)、脾組織更適于推斷死后經(jīng)過時(shí)間。不同管家基因之間也存在一定的表達(dá)差異，應(yīng)該進(jìn)一步篩選穩(wěn)定性好的管家基因。非管家基因的波動(dòng)性較強(qiáng)，不適于推斷死后經(jīng)過時(shí)間。 2.法醫(yī)學(xué)尸體組織中rRNA各類亞基的穩(wěn)定性與管家基因類似，除18srRNA表達(dá)波動(dòng)性較強(qiáng)外，其余rRNA亞基（5s、5.8s、28s）可以作為內(nèi)參基因用于死后經(jīng)過時(shí)間推斷，其表達(dá)規(guī)律性尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。 3.嬰幼兒組織中管家基因的表達(dá)與成人相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在今后研究中應(yīng)加以注意。
【關(guān)鍵詞】：法醫(yī)病理學(xué) 管家基因 rRNA亞基 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 法醫(yī)學(xué)尸體組織
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：D919
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-12
• 材料與方法12-16
• 結(jié)果16-52
• 討論52-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-60
• 附表 1 研究案例的個(gè)體信息60-61
• 綜述61-67
• 參考文獻(xiàn)65-67
• 個(gè)人簡介67-68
• 致謝68

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本文編號(hào)：277135