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人參皂苷生物合成研究進展

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人參皂苷生物合成研究進展

楊金玲, 高麗麗, 朱 平*

(中國醫(yī)學科學院、北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所, 天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室 &

衛(wèi)生部天然藥物生物合成重點實驗室, 北京 100050)

摘要: 人參皂苷是名貴藥材人參和西洋參等人參屬植物的主要有效成分, 具有較好的抗腫瘤、抗炎、抗氧化
和抑制細胞凋亡等藥理活性。但人參皂苷在人參和西洋參中含量很低, 大大限制了其開發(fā)與應用, 利用生物技術(shù)
手段合成人參皂苷并提高其含量已成為研究熱點。近年來通過組織培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化進行人參皂苷生物合成的研
究取得了一些進展。在人參皂苷生物合成途徑解析及其反應機制研究方面, 目前已從人參屬植物中克隆到 20 多
個與人參皂苷生物合成相關的基因并進行了功能驗證, 為通過合成生物學技術(shù)生產(chǎn)人參皂苷提供了基本的元器
件。本文就以上幾個方面的研究進展進行綜述, 為人參皂苷生物合成途徑及其調(diào)控的深入研究提供理論依據(jù)。
關鍵詞: 人參皂苷; 合成生物學; 組織培養(yǎng); 生物轉(zhuǎn)化

中圖分類號: R931 文獻標識碼: A 文章編號: 0513-4870 (2013) 02-0170-0

Advances in the biosynthesis research of ginsenosides
YANG Jin-ling, GAO Li-li, ZHU Ping*
(State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines & Key Laboratory of Biosynthesis of
Natural Products, Ministry of Health of PRC, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences &
Peking Union Medical College, Beijing 100050, China)
Abstract: Ginsenosides are the main active components of medicinal herbs including Panax ginseng and
Panax quinquefolium, which have potent effects of anti-tumor, anti-inflammatory, antioxidant and apoptosis
inhibition. But the low content of ginsenosides limits its development and usage. At present, how to improve
the production of ginsenosides by biological technology has been a new research focus. Some advances in the
biosynthesis of ginsenosides by tissue culture and biotransformation have been made in recent years. So far at
least twenty genes related to the biosynthesis of ginsenosides from Panax genus plants have been cloned and
functionally identified, which has laid a good foundation for the study on the synthetic biology of ginsenosides.
This review outlines recent advances in several aspects and is expected to provide a theoretical support to the
thorough research of the pathway and regulation of ginsenosides biosynthesis.
Key words: ginsenoside; synthetic biology; tissue culture; biotransformation

人參皂苷是名貴藥材人參和西洋參等人參屬植物的主要有效成分。現(xiàn)代藥理學研究表明, 人參皂苷具有較好的抗腫瘤、抗炎、抗氧化和抑制細胞凋亡等藥理活性[1]。人參皂苷屬于三萜類, 是由苷元和糖相連而成的糖苷類化合物。根據(jù)苷元不同, 人參皂苷可
分為 3 種類型: 一類是齊墩果烷型五環(huán)三萜類皂苷Ro, 其皂苷元為齊墩果酸; 另兩類是人參二醇型皂苷 (如 Rb1、Rb2、Rc、Rd、F2、Rg3、Rh2 等) 和人參三醇型皂苷 (如 Re、Rg1、Rg2、Rf、Rh1 等), 兩者均屬于達瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷, 它們在人參皂苷中占大多數(shù), 是其中的主要活性成分。迄今為止,已經(jīng)分離并確定結(jié)構(gòu)的人參皂苷約有 60 余種。多數(shù)皂苷單體具有顯著藥理作用, 新藥開發(fā)前景較好,如 Rg1、Rb1 具有抗衰老活性, Rg3、Rh2 具有抗腫瘤活性等[2]。
人參皂苷在人參和西洋參中含量較低, 有限的天然資源難以滿足日益增長的醫(yī)藥及研發(fā)需求, 而且長期依靠采集野生資源作為藥源, 必然導致天然資源的枯竭, 嚴重破壞生態(tài)平衡。而人工種植人參、西洋參需要 4～15年的生長栽培周期, 又面臨農(nóng)藥殘留、重金屬污染及品種退化等問題, 這些都是大規(guī)模推廣種植的制約因素。為了擺脫藥源匱乏的困境, 同時保護珍貴的天然資源, 近年來國內(nèi)外學者通過組織培養(yǎng)、生物轉(zhuǎn)化及合成生物學等途徑對人參皂苷的生物合成進行了探索, 取得了一些成果。本文就這些進展進行了綜述, 并展望了人參皂苷生物合成的發(fā)展前景。
1 利用組織培養(yǎng)解決人參資源緊缺的研究
從 20 世紀中期開始, 許多研究者就開始致力于人參和西洋參的組織培養(yǎng)研究, 試圖通過組織和細胞培養(yǎng)解決這些貴重藥材的資源供應問題, 或通過試管苗的獲得使其快速繁殖成為可能。關于人參和西洋參的組織培養(yǎng)研究, 近年來已有多篇綜述文章報道[3, 4]。植物組織與細胞培養(yǎng)要達到工業(yè)化生產(chǎn),最終必須建立起大規(guī)模培養(yǎng)的方法——反應器培養(yǎng)。日本已經(jīng)在 20 000 L 生物反應器上成功地進行了每月100 kg的人參細胞培養(yǎng), 用于生產(chǎn)食品添加劑, 培養(yǎng)物中人參皂苷的含量組成與栽培的人參根幾乎完全一致[5]。韓國也已經(jīng)在人參不定根和毛狀根的發(fā)酵培養(yǎng)方面取得了較大進展, 反應器的規(guī)模已達到10 000 L[6]。我國已經(jīng)通過人參愈傷組織培養(yǎng)開發(fā)出丁家宜系列化妝品等[7]。
盡管人參和西洋參的組織與細胞培養(yǎng)研究已經(jīng)比較深入, 在細胞培養(yǎng)、毛狀根和冠癭瘤培養(yǎng)以及反應器培養(yǎng)等方面都取得了一些進展, 但仍存在一些問題, 如細胞株不穩(wěn)定、放大培養(yǎng)困難、目的產(chǎn)物含量低及培養(yǎng)條件復雜導致成本高等, 因此需要尋求更合適的培養(yǎng)條件和易于工業(yè)化生產(chǎn)的技術(shù)方式,以滿足人們對人參和西洋參藥材以及人參皂苷類成分的醫(yī)藥及研發(fā)需求。
2 通過生物轉(zhuǎn)化獲得稀有人參皂苷和苷元的研究
各種人參皂苷在人參屬植物中含量不同, 并且具有不同的藥理功能。有些人參皂苷含量較高, 如Rb1 和 Rg1, 而另外一些人參皂苷含量甚微, 為稀有人參皂苷, 如 Rh1、Rh2、Rh3 和 Rg3 等[2]。許多藥理研究表明, 稀有人參皂苷通常具有更好的藥理活性。人參皂苷苷元的抗腫瘤活性最強, 隨著糖基數(shù)目的增加, 人參皂苷抗腫瘤活性依次減弱, 即: 苷元 >單糖苷 > 二糖苷 > 三糖苷 > 四糖苷[8]。通過研究人參皂苷在體內(nèi)的代謝規(guī)律, 也發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)人參皂苷在胃腸道中吸收較差, 脫去糖基的次級苷和苷元比皂苷具有更強的藥理活性和更高的生物利用度[9−11]。稀有人參皂苷和苷元在人參原植物、細胞培養(yǎng)物、不定根及毛狀根中含量甚微, 以前主要通過物理法和化學法水解皂苷糖苷鍵獲得, 但水解條件劇烈, 不易控制, 反應副產(chǎn)物多, 而且排放大量有機溶劑、酸和堿等污染物, 對環(huán)境造成很大危害。為了避免破壞生態(tài)環(huán)境, 且得到可持續(xù)利用的資源, 許多研究者通過生物轉(zhuǎn)化途徑改變?nèi)藚⒃碥盏奶擎溄Y(jié)構(gòu), 以獲得稀有人參皂苷和苷元[12]。生物轉(zhuǎn)化就是利用有機體 (細胞、細胞器) 或酶作為催化劑實現(xiàn)化學轉(zhuǎn)化的過程, 是生物體系 (包括細菌、真菌和植物組織等) 對外源性底物進行結(jié)構(gòu)修飾的化學反應。其本質(zhì)是利用生物本身所產(chǎn)生的酶對外源底物進行的催化反應。生物轉(zhuǎn)化具有選擇性強、反應條件溫和、副產(chǎn)物少、后處理簡單及對環(huán)境友好等優(yōu)點。近年來, 以人參皂苷為原料進行生物轉(zhuǎn)化的研究越來越多, 獲得了許多有意義的成果。人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化主要是利用微生物或酶對人參二醇型皂苷的 C3 和 C20 位、三醇型皂苷的 C6 和 C20 位的糖基結(jié)構(gòu)進行修飾, 使含量較高的人參皂苷的糖基經(jīng)過水解作用, 定向轉(zhuǎn)化為稀有皂苷和苷元[13]。生物轉(zhuǎn)化的方法主要有微生物轉(zhuǎn)化法和酶轉(zhuǎn)化法。
2.1 微生物轉(zhuǎn)化 

微生物轉(zhuǎn)化法成本低、副產(chǎn)物少、應用廣泛。許多研究者模擬人參皂苷的體內(nèi)代謝, 通過一些腸內(nèi)菌群對人參皂苷進行轉(zhuǎn)化, 發(fā)現(xiàn)人參皂苷發(fā)揮作用的真正有效成分是苷元, 這為開發(fā)新藥奠定了基礎[14]。Bae 等[15]從腸道菌群中分離出可以將人參皂苷轉(zhuǎn)化成 Compound K 的乳酸菌, 還通過腸道菌 Bacteroides sp.、Eubacterium sp.、Bifidobacterium sp.將 Rg3 轉(zhuǎn)化為 Rh2 和 PPD[16]。對人參皂苷進行生物轉(zhuǎn)化的微生物除了腸道菌以外, 還有曲霉屬、青霉屬、根霉屬及毛霉屬等霉菌[17]。Dong 等[18]發(fā)現(xiàn)小型絲狀真菌黑曲霉 (Aspergillus niger 3.1858) 和藍色犁頭霉 (Absidia coerulea 3.3538) 具有將 Rg1 轉(zhuǎn)化為 Rh1 的能力, 轉(zhuǎn)化率為 80.9%。付建國[19]應用大型藥食兩用菌與西洋參及其根部提取物進行共培養(yǎng), 并以固態(tài)發(fā)酵法對人參皂苷進行生物轉(zhuǎn)化, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌體生長所分泌的酶系對二醇型皂苷有分解的功能, 對三醇型皂苷的分解功能極弱, 可以產(chǎn)生Compound K。Cheng 等[20]通過能產(chǎn)生 β-葡萄糖苷酶的 Caulobacter leidyia 將人參皂苷 Rb1 轉(zhuǎn)化為 F2。包海鷹等[21]利用黑根霉 (Rhizopus sp.) 將人參皂苷Re 轉(zhuǎn)化為 Rg1、Rg5 和 Rk1, 轉(zhuǎn)化率可達 92.16%。崔宇等[22]從種植人參的土壤中分離了 4 個菌株, 通過對人參果總皂苷 (SFPG) 進行轉(zhuǎn)化, 篩選出一株能轉(zhuǎn)化得到 Compound K 的鐮刀霉屬霉菌 (Fusariumspp.), 該 菌 株 轉(zhuǎn) 化 專 一 性 強 , 轉(zhuǎn) 化 效 率 高 , 為Compound K 的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一條新途徑。戴均貴等[23, 24]在人參皂苷生物轉(zhuǎn)化方面也做過大量的工作, 通過尖孢鐮孢霉 (F. oxysporum) Z-001 將 Rg1 和Rb1 進行轉(zhuǎn)化, 共得到 9 個代謝產(chǎn)物, 其6α,12β-dihydroxydammar-3-one-20(S)-O-β-D-glucopyranoside和 3a-oxa-3a-homo-6α, 12β-dihydroxydammar-3-one-20(S)-O-β-D-glucopyranoside 為新化合物; 通過藍色犁頭霉 AS3.2462 將 Rg1 轉(zhuǎn)化為 5 個代謝產(chǎn)物, 其中3-oxo-7β-hydroxy-20(S)-protopanaxatriol 和 3-oxo-7β,15α-dihydroxy-20(S)-protopanaxatriol 為新化合物。
2.2 酶轉(zhuǎn)化 

相對于微生物轉(zhuǎn)化而言, 酶轉(zhuǎn)化法反應周期短, 污染小, 所得的產(chǎn)物純度高, 可控性強,而且具有一定的專屬性, 不同性質(zhì)的酶作用于不同構(gòu)型、不同組成的糖苷鍵, 從而可以定向形成目的產(chǎn)物。Ko 等[25]對各種糖苷水解酶水解三醇型皂苷混合物進行了研究。利用來源于米曲霉 (Aspergillusoryzae) 的半乳糖苷酶和青霉菌 (Penicillium sp.)的乳糖酶粗酶液水解三醇型皂苷混合物, 分別產(chǎn)生了大量的 Rg2 和 Rh1; 利用來源于斜臥青霉 (P.decumbens) 的柚皮苷酶粗酶液水解三醇型皂苷混合物, 產(chǎn)生了腸道菌代謝產(chǎn)物 F1 和少量的 20(S)-PPT。這是首次利用酶解法轉(zhuǎn)化三醇型皂苷混合物高效制備 Rg2、Rh1 和 F1 的報道。后來又對各種糖苷水解酶轉(zhuǎn)化二醇型皂苷混合物進行了研究, 發(fā)現(xiàn)來源于米曲霉的乳糖酶、β-半乳糖苷酶和來源于綠色木霉(Trichoderma viride) 的纖維素酶粗酶液可分別轉(zhuǎn)化產(chǎn)生 F2、Compound K 和 Rd; 來源于青霉菌的乳糖酶粗酶液可轉(zhuǎn)化產(chǎn)生 Rd、Rg3 和 Compound K。這是利用二醇型皂苷混合物酶法大量制備 F2 和 Rg3 的首次報道[26]。Liu 等[27]利用從黑曲霉中得到的粗糖苷酶轉(zhuǎn)化Rg3(R)為 PPD(S, R), 轉(zhuǎn)化率高達 100%; 轉(zhuǎn)化Rf為20(S)-PPT, 轉(zhuǎn)化率為90.4%[28]。金鳳燮研究組[29]圍繞酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)稀有皂苷 Rh2 開展了大量的工作。利用新發(fā)現(xiàn)的人參皂苷 β-葡萄糖苷酶, 部分水解人參二醇型皂苷糖基, 經(jīng)過轉(zhuǎn)化生產(chǎn) Rh2 等皂苷。他們篩選育種了產(chǎn)酶工程菌, 開發(fā)出酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物次生皂苷的分離純化技術(shù), 通過酶轉(zhuǎn)化法可以產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)Rh2。這種方法經(jīng)生產(chǎn)實踐表明, 從人參二醇型皂苷生產(chǎn) Rh2 的轉(zhuǎn)化率為 60%以上, Rh2 純度達 90%, Rh2的收率為人參原料的 0.5%以上, 比從紅參中提取的產(chǎn)率提高 500 倍。反應后酶的回收率是 60%。

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展, 近年來一些研究者開始嘗試將糖苷酶基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌, 通過高表達得到的重組酶對人參皂苷進行生物轉(zhuǎn)化, 已取得了一些進展。Noh 等[30]將從 Sulfolobus solfataricus 中克隆到的 β-糖苷酶基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌, 得到的重組酶能將人參根提取物轉(zhuǎn)化為 Compound K, 轉(zhuǎn)化率為80.5%。Yoo 等[31]將從火球菌屬的 Pyrococcus furiosus中克隆的 β-糖苷酶基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌, 得到的重組酶將人參根提取物首先轉(zhuǎn)化成 Compound K, 轉(zhuǎn)化率為 79.5%, 然后轉(zhuǎn)化成苷元 PPD, 轉(zhuǎn)化率為 100%,苷元的產(chǎn)量可達 1.8 g·L−1。該研究在已報道的文獻中,Compound K 和苷元的產(chǎn)率是最高的, 因此具有較好的產(chǎn)業(yè)化前景。

人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化雖已取得了較大的進展,但為了實現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化, 必須篩選到可以專一性轉(zhuǎn)化的高產(chǎn)菌株及酶, 或通過基因工程得到具有高轉(zhuǎn)化活性的重組酶, 再建立合適的工業(yè)生產(chǎn)條件, 這對于大規(guī)模生產(chǎn)人參皂苷類衍生物及其創(chuàng)新藥物研究具有重大意義。
3 人參皂苷合成生物學研究探索
天然藥物合成生物學是在基因組學研究的基礎上, 對天然藥物生物合成相關元器件進行發(fā)掘和表征, 借助工程學原理對其進行設計和標準化, 通過在底盤細胞中裝配與集成, 重建生物合成途徑和代謝網(wǎng)絡, 從而實現(xiàn)藥用活性成分定向、高效的異源合成, 以解決天然藥物研發(fā)和生產(chǎn)制造的一系列重大問題[32]。在天然藥物設計合成領域, 合成生物學的應用使人們能夠更為精確地控制代謝途徑, 利用對天然產(chǎn)物生物合成途徑的遺傳操作來生產(chǎn)基于天然產(chǎn)物的創(chuàng)新藥物分子, 也可以設計和構(gòu)建一些能夠生產(chǎn)重要天然藥物的人工合成的“超級產(chǎn)生菌”, 只需對“超級產(chǎn)生菌”進行發(fā)酵就可以直接獲得所需的目的化合物, 有望成為未來最有前途的藥物生產(chǎn)的綠色環(huán)保技術(shù)之一, 可以有效解決植物來源的天然藥物研發(fā)可能引起的資源問題。目前合成生物學已在一些藥用天然產(chǎn)物的制造中獲得了較大的進展。王偉等[33]首次從中國紅豆杉中克隆到紫杉烯合酶基因, 將其導入釀酒酵母組建了一條紫杉烯生物合成途徑, 重組菌可以直接產(chǎn)生紫杉醇的前體—紫杉烯,為紫杉醇類化合物的合成生物學研究奠定了基礎。Ajikumar 等[34]利用大腸桿菌實現(xiàn)了紫杉醇關鍵前體紫杉烯的發(fā)酵生產(chǎn), 通過分批補料培養(yǎng) (fed-batchcultivation) 產(chǎn)量可達 1 g·L−1, 這意味著將來有望通過進一步優(yōu)化紫杉醇生物合成的其他步驟, 最終實現(xiàn)通過合成生物學途徑大量制備紫杉醇。孔建強等[35]通過將青蒿素生物合成相關基因轉(zhuǎn)入釀酒酵母, 得到了青蒿素前體紫穗槐-4, 11-二烯和青蒿酸, 而且將紫穗槐-4, 11-二烯合酶進行全基因優(yōu)化, 使紫穗槐-4,11-二烯合酶催化效率顯著提高, 進而大大提高了工程菌中紫穗槐-4, 11-二烯的產(chǎn)率。Westfall 等[36]構(gòu)建了生產(chǎn)紫穗槐-4, 11-二烯的釀酒酵母工程菌, 通過分批補料培養(yǎng)產(chǎn)量可達 40 g·L−1, 并將其半合成為青蒿素的直接前體二氫青蒿酸, 總得率為 48.4%, 這使得通過合成生物學途徑大量制備青蒿素前體成為可能,將會簡化青蒿素的合成路線, 從而大幅降低青蒿素
的生產(chǎn)成本。
近年來, 關于人參皂苷生物合成途徑及其反應機制的研究已取得了一些進展, 為通過合成生物學技術(shù)生產(chǎn)人參皂苷奠定了基礎[37, 38]。人參皂苷生物合成途徑包括 20 余步連續(xù)的酶促反應 (圖 1)。其中的關鍵酶有 3-羥基-3-甲基戊二酰 CoA 還原酶 (3-
hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, HMGR)、法呢基焦磷酸合酶 (farnesyl diophosphate synthase,FPS)、鯊烯合酶 (squalene synthase, SS)、鯊烯環(huán)氧酶 (squalene epoxidase, SE)、達瑪烯二醇-II 合酶(darmmarenediol-II synthase, DS)、β-香 樹素 合酶(β-amyrin synthase, AS)、細胞色素 P450 (cytochromeP450, CYP450) 和糖基轉(zhuǎn)移酶 (glycosyltransferase,
GT) 等。

3.1 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A 還原酶 (HMGR)
HMGR 被公認為人參皂苷生物合成途徑中的第一個限速酶, 是萜類合成過程中最先起作用的關鍵酶, 通過影響人參皂苷前體 IPP 和DMAPP 的產(chǎn)量而影響人參皂苷的生物合成。Wu 等[39]從 4 年生西洋參根中克隆到 HMGR 基因, 其編碼的蛋白由 589 個氨基酸組成, 生物信息學分析表明 HMGR 含有兩個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個催化結(jié)構(gòu)域。該基因與從許多植物中克隆到的 HMGR 基因具有較高的同源性, 尤其是與喜樹的HMGR基因的同源性高達83.8%, 而喜樹中的單萜類吲哚生物堿——喜樹堿的生物合成須通過甲羥戊酸 (mevalonate, MVA) 途徑, 由此推斷 HMGR 基因與人參皂苷的生物合成密切相關。

3.2 法呢基焦磷酸合酶 (FPS)

Kim 等[40]從人參根中克隆到編碼 FPS 的基因 PgFPS, 其編碼的氨基酸序列與擬南芥、橡膠、黃花蒿和積雪草的 FPS 分別有 77%、84%、87% 和 95% 的同源性。Southern blot分析表明, 人參中有兩個以上的基因編碼 FPS。通過大腸桿菌表達 PgFPS 確證了重組蛋白具有 FPS 的活性。用茉莉酸甲酯處理人參的毛狀根能夠同時提高 PgFPS 的 mRNA 水平和 FPS 的活性。之前有過茉莉酸甲酯誘導人參根懸浮細胞中人參皂苷積累的報道[41], 極有可能與 PgFPS 的表達水平提高有關。Kim等[42]還將人參的 PgFPS 轉(zhuǎn)到積雪草毛狀根中使其過量表達, 發(fā)現(xiàn)積雪草達瑪烷合酶的 mRNA 水平顯著提高, 三萜皂苷羥基積雪草苷和積雪草苷的產(chǎn)量瞬時升高。上述研究表明, FPS 在三萜類化合物的生物合成中起著重要作用, 是運用合成生物學技術(shù)提高人參皂苷產(chǎn)量的一個重要元器件。

3.3 鯊烯合酶 (SS) 

SS 處于類異戊二烯途徑的一

個分支點, 催化甾醇和三萜類化合物合成的起始步驟, 其含量和活性對人參皂苷的產(chǎn)量起著非常重要的作用。Lee 等[43]從以人參葉為材料構(gòu)建的 cDNA 文庫中克隆到 SS 基因 PgSS1, 該基因與大豆、擬南芥、煙草和水稻中的 SS 基因分別具有 84.1%、75.78%、81.45% 和 71.33% 的同源性。構(gòu)建了 SS 基因的植物表達載體, 通過轉(zhuǎn)化人參得到不定根來上調(diào)該基因的表達, 結(jié)果表明所有的下游基因表達都得到了上調(diào), 從而導致甾醇和人參皂苷的增加, 表明 SS 對甾醇和人參皂苷的生物合成均起著調(diào)控作用。Kim 等[44]從以不定根為材料構(gòu)建的表達序列標簽 (EST) 文庫中克隆到另外兩個 PgSS1同源基因: PgSS2和 PgSS3。功能互補分析表明, PgSS1、PgSS2 和 PgSS3 都能使釀酒酵母 SS 基因缺陷型突變體回復為麥角甾醇原養(yǎng)型。原位雜交分析表明, 這 3 個基因在人參不同器官中的轉(zhuǎn)錄水平不同。這些結(jié)果表明這 3 個 SS 基因表達模式不同但都參與人參的鯊烯合成。Seo 等[45]通過根癌農(nóng)桿菌介導將人參的 SS 基因轉(zhuǎn)入刺五加愈傷組織, 使其表達代謝終產(chǎn)物。結(jié)果表明, 增強人參 SS的活性會使甾醇的產(chǎn)量顯著增加, 同時也能提高三萜皂苷的產(chǎn)量。因此推斷 SS 是人參皂苷合成的一個關鍵酶, 提高 SS 表達量不僅促進 FPP 向鯊烯的轉(zhuǎn)化,同時還能上調(diào)下游其他酶的活性, 進而提高甾醇和三萜類化合物的產(chǎn)量。蔣世翠等[46]根據(jù)人參 SS 基因設計正義及反義片段引物, 構(gòu)建了 SS 基因干擾表達載體, 通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化人參愈傷組織, 轉(zhuǎn)化后的愈傷組織 SS 基因表達量降低, 皂苷含量也有所變化,由此推斷 SS 是人參皂苷生物合成途徑的關鍵酶, 抑制 SS 基因的表達可調(diào)控人參皂苷的產(chǎn)量。因此, SS也是利用合成生物學技術(shù)提高人參皂苷產(chǎn)量的一個
非常重要的元器件。

3.4 鯊烯環(huán)氧酶 (SE) 

SE 催化甾醇和三萜類生物合成的第一步氧化反應, 被認為是其合成的限速酶之一。Han 等[47]分別從以人參葉片和不定根為材料構(gòu)建的 cDNA文庫中克隆到 PgSQE1 和 PgSQE2 兩個SE 基因, 通過 PgSQE1 的 RNA 干擾 (RNAi) 技術(shù)發(fā)現(xiàn), 在轉(zhuǎn)基因人參根中 PgSQE1 的沉默可以明顯上調(diào) PgSQE2 和環(huán)阿屯醇合酶 (cycloartenol synthase,CAS) 的表達, 從而導致甾醇含量的提高。此結(jié)果表明 PgSQE1 和 PgSQE2 具有不同的調(diào)控機制, PgSQE1只參與人參皂苷的合成, 而與甾醇的產(chǎn)生無關。蔣世翠等[48]探討了西洋參不同組織器官中總皂苷和單體皂苷量的差異及其與 SS 和 SE 基因表達量之間的關系, 發(fā)現(xiàn) SS 和 SE 基因在 14 個組織器官中的表達量具有非常顯著的差異, 并與人參皂苷 Re、Rg1、Rb1、Rd 和總皂苷量之間存在顯著的正相關關系。由此可見, SS 和 SE 在人參皂苷合成途徑中都起著極其重要的作用。

3.5 達瑪烯二醇-II合酶 (DS) 和β-香樹素合酶 (AS)
由氧化鯊烯環(huán)化酶 (oxidosqualene cyclase, OSC) 催化的 2, 3-氧化鯊烯環(huán)化是三萜皂苷和甾醇生物合成分支形成的關鍵位點。OSC 構(gòu)成多基因家族, 由氧化鯊烯環(huán)化可產(chǎn)生 100 多種不同骨架的三萜類化合物。目前已經(jīng)從各種不同植物中克隆到 OSC 基因。從人參中克隆到與人參皂苷合成相關的 OSC 基因有兩個,即 DS 和 AS 基因, 分別是合成達瑪烷型和齊墩果烷型人參皂苷的關鍵酶基因。Kushiro 等[49]以人參毛狀根為材料制備微粒體, 發(fā)現(xiàn)其在體外能將 2, 3-氧化鯊烯環(huán)化為達瑪烯二醇-II。Tansakul 等[50]根據(jù) OSC基因保守序列設計簡并引物, 從人參毛狀根中克隆到 DS 基因 PNA, 該基因轉(zhuǎn)入釀酒酵母后能催化產(chǎn)生達瑪烯二醇-II。Han 等[51]從以人參花為材料構(gòu)建的EST 文庫中克隆到一個 DS 基因 DDS, 與上述 PNA基因序列一致。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入 DDS 基因的釀酒酵母能產(chǎn)生達瑪烯二醇-II 和羥基達瑪烯酮; 茉莉酸甲酯能上調(diào) DDS 基因的表達; 通過 RNAi 技術(shù)使 DDS
基因沉默能使人參根中的皂苷產(chǎn)量降低到原來的84.5%。Lee 等[52]將 DDS 基因轉(zhuǎn)入煙草中, 使煙草產(chǎn)生了達瑪烯二醇-II, 從而使煙草對煙草花葉病毒的抵抗力明顯提高。這些結(jié)果表明 DS 在人參皂苷的生物合成途徑中起著非常重要的作用, 是采用合成生物學技術(shù)獲得達瑪烷型人參皂苷的一個重要元器件。AS 催化 2, 3-氧化鯊烯環(huán)化合成 β-香樹素, 是目前為止發(fā)現(xiàn)的齊墩果烷型人參皂苷 Ro 合成的唯一關鍵酶。Kushiro 等[53]從人參毛狀根中克隆到了 AS的 cDNA 序列 PNY, 將 PNY 轉(zhuǎn)入釀酒酵母可催化產(chǎn)生 β-香樹素。趙壽經(jīng)等[54]也從人參毛狀根中克隆到了AS基因, 并成功構(gòu)建了AS基因的反義植物表達載體, 試圖通過建立 AS 基因的反義表達載體, 利用反義 RNA 技術(shù)抑制 AS 基因的表達, 使代謝流主要流向達瑪烷型三萜皂苷支路, 從而達到提高人參皂苷含量的目的。

3.6 細胞色素P450 (CYP450)

CYP450對人參皂苷

三萜碳環(huán)骨架進行羥基化和氧化等復雜修飾作用,是人參皂苷生物合成途徑中的關鍵酶。近年來利用新一代測序技術(shù)及生物信息學分析等方法, 篩選出了參與人參皂苷生物合成的相關 CYP450, 并對候選基因進行了生物功能驗證, 進一步闡明了人參皂苷生物合成途徑[55]。Han 等[56]對茉莉酸甲酯誘導的人參不定根進行了轉(zhuǎn)錄組測序, 通過拼接、注釋及擴增得到 9 個候選 CYP450 全長基因。其中 CYP716A47基因不僅可響應茉莉酸甲酯誘導表達量上調(diào), 而且轉(zhuǎn)入過量表達 SS 基因的轉(zhuǎn)基因人參植株后能使人參根中皂苷的產(chǎn)量提高。將 CYP716A47 基因轉(zhuǎn)入釀酒酵母, 表達的重組蛋白能催化達瑪烯二醇-II 的C-12 位羥基化而使其轉(zhuǎn)化為原人參二醇。將 DS 與CYP716A47 同時轉(zhuǎn)入釀酒酵母, 重組菌株中檢測到了原人參二醇的產(chǎn)生。該報道首次對參與人參皂苷合成的 CYP450 進行了功能確證。陳士林[57]課題組應用高通量 454GS FLX 測序技術(shù)進行人參、西洋參和三七轉(zhuǎn)錄組研究, 在大量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘CYP450,為進一步篩選參與人參皂苷合成的 CYP450 提供了重要依據(jù)。Sun 等[58]對西洋參根進行高通量測序, 通過拼接、注釋得到 150 個 CYP450。選取其中轉(zhuǎn)錄水平最高的 27 個 CYP450 進行茉莉酸甲酯誘導實驗,在根、莖、葉和花組織中僅 contig00248 轉(zhuǎn)錄本與 DS表達模式一致。轉(zhuǎn)錄本 contig00248 在系統(tǒng)進化上與擬南芥 CYP88 家族較近, 文章把 contig00248 轉(zhuǎn)錄本作為氧化達瑪烯二醇-II 或原人參二醇的關鍵候選CYP450。Luo 等[59]對三七根進行高通量測序, 進而拼接、注釋和擴增得到 15 個全長 CYP450。其中Pn00158 轉(zhuǎn)錄本與西洋參候選 CYP450 contig00248轉(zhuǎn)錄本具有極高的相似性, 并且與已進行功能確證的人參CYP716A47的氨基酸序列同源性高達97.95%,由此推斷 Pn00158 極有可能是三七中參與人參皂苷合成的 CYP450。Han 等[60]從茉莉酸甲酯誘導的人參不定根 EST 文庫中克隆到 CYP716A53v2, 將其轉(zhuǎn)入釀酒酵母后表達的重組蛋白能催化原人參二醇的C-6 位羥基化而使其轉(zhuǎn)化為原人參三醇。上述關于人參皂苷相關 CYP450 的研究進展, 大大推進了人參皂苷生物合成途徑的研究, 也為通過合成生物學技術(shù)生產(chǎn)人參皂苷的探索提供了重要的元器件。

3.7 糖基轉(zhuǎn)移酶 (GT) 

GT 催化的糖基化反應是人參皂苷生物合成的最后一步, 其主要過程是將核苷二磷酸活性糖分子轉(zhuǎn)移到人參皂苷苷元底物上, 從而形成糖苷鍵。糖基化可以增加人參皂苷的穩(wěn)定性和水溶性, 這一過程也決定了其多樣性。GT 也是以基因家族的形式存在于植物體內(nèi), 具有高度的專一性。轉(zhuǎn)移的糖基不同或糖基的受體不同, 所需的 GT 也不同。陳欣等[61]首次從人參毛狀根中提取分離了一種GT, 用 SDS-PAGE 測定其分子質(zhì)量為 56.6 kD, 并對其酶學特征進行了初步研究。Yue 等[62]從三七懸浮細胞中分離純化了一種 GT, 能將 Rd 轉(zhuǎn)化為 Rb-1。但迄今為止尚未有從人參屬植物中克隆到 GT 基因的報道。糖基化是人參皂苷生物合成途徑中最下游的步驟, 進行深入研究對選擇性地獲得具有較高價值的人參皂苷具有重要意義。

綜上所述, 人參皂苷生物合成途徑的基本框架及相關酶的研究已經(jīng)取得了較大的進展。目前已從人參和西洋參等人參屬植物中克隆到 20 多個編碼人參皂苷生物合成相關酶的基因并進行了功能驗證,為通過合成生物學技術(shù)生產(chǎn)人參皂苷提供了基本的生物元器件, 為該研究奠定了較好的基礎。在驗證人參皂苷生物合成相關關鍵酶基因功能時一般用釀酒酵母作為底盤細胞, 這是因為釀酒酵母具備作為一個優(yōu)良底盤細胞所需的特征, 如能在營養(yǎng)成分簡單的培養(yǎng)基上生長, 容易利用生化反應器放大生產(chǎn)規(guī)模, 有多個營養(yǎng)缺陷型供選擇, 并有多個選擇標記可使用, 尤其是釀酒酵母通過自身固有的 MVA 途徑產(chǎn)生的 2, 3-氧化鯊烯正是合成人參皂苷的前體, 這為人參皂苷代謝途徑在釀酒酵母中的組建提供了很大的便利。此外, 鑒于有些人參皂苷的糖基并不是發(fā)揮藥理作用所必需的, 脫去所有糖基的人參皂苷苷元的藥理活性反而比人參皂苷更強, 因此通過合成生物學途徑直接獲得人參皂苷苷元也具有非常重要的意義。
4 結(jié)語
人類日益增長的醫(yī)藥及研發(fā)需求使人參、西洋參及其皂苷成為研究熱點, 上述幾個方面的研究已取得了一些進展。除了人參和西洋參的人工種植以外,國內(nèi)外報道的獲取人參皂苷的幾種途徑還包括組織培養(yǎng)、生物轉(zhuǎn)化和合成生物學技術(shù)等。組織培養(yǎng)是目
前解決藥源問題的重要途徑, 鑒于人參皂苷的代謝途徑已經(jīng)逐漸明晰, 因此可以通過基因工程技術(shù)提高關鍵酶基因的表達量以提高人參皂苷的合成水平,獲得高產(chǎn)細胞株, 從而更加有效地緩解日益增長的醫(yī)藥及研發(fā)需求。生物轉(zhuǎn)化在獲取稀有人參皂苷及苷
元方面具有較為突出的優(yōu)勢, 而且還可能獲得一些天然植物中不存在的人參皂苷類衍生物。人參皂苷的合成生物學研究也是一種具有廣闊發(fā)展前景的途徑。人參皂苷的生物合成是一個受多因素調(diào)節(jié)的復雜動態(tài)過程, 為了實現(xiàn)通過合成生物學途徑生產(chǎn)人參皂苷的目標, 不僅要將克隆到的相關關鍵酶基因轉(zhuǎn)入合適的底盤細胞, 通過人工改造這些基因使其異源高效表達, 還要對調(diào)控人參皂苷代謝網(wǎng)絡的一些調(diào)控基因進行深度挖掘, 以找到開啟整個代謝網(wǎng)絡的開關, 從而整體提高整個代謝途徑中基因的表達水平, 更加有效地提高人參皂苷的產(chǎn)量。迄今為止, 人參皂苷的合成生物學研究雖在生物元器件的獲得及其功能驗證方面有一些較大的進展, 但底盤細胞的改造、代謝途徑的裝配等研究剛剛起步, 所以相關學科應聯(lián)合攻關, 共同推進這項研究的發(fā)展。
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  本文關鍵詞：人參皂苷生物合成研究進展，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：55329