【摘要】：類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種發(fā)病原因不明,以持續(xù)性滑膜炎和全身關(guān)節(jié)性軟骨及骨破壞為特點的慢性自身免疫疾病,RA以滑膜炎癥和滑膜組織增生為主要病理特征,可引起關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)破壞,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能障礙,是人類主要的致殘原因之一�；こ衫w維細胞(synovial fibroblasts, FLS)在RA病理過程中起到了關(guān)鍵作用。在臨床病理上RA-FLS具有類腫瘤樣異常增殖、抗凋亡和釋放高水平促炎性細胞因子的特性。FLS參與了RA發(fā)病過程中的各個環(huán)節(jié),在RA病情進展中扮演著重要角色,RA-FLS通過分泌產(chǎn)生炎性介質(zhì)、促炎性細胞因子和抗炎癥細胞因子調(diào)控免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng),導(dǎo)致了RA滑膜組織增生：同時,RA-FLS分泌基質(zhì)金屬蛋白酶等參與胞外基質(zhì)降解及骨關(guān)節(jié)破壞,促進血管新生。越來越多的證據(jù)表明,通過抑制RA-FLS的增殖,能有效防止RA患者的關(guān)節(jié)損傷,最大限度的改善病情以提高患者生活質(zhì)量。因此,抑制類風濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞的增殖可能是治療RA的一種可行有效的臨床方案,具有廣闊的前景。由熱殺死結(jié)核分枝桿菌(Heat-killed M.tuberculousis H37Ra, Mtb)誘導(dǎo)的佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠(Adjuvant Arthritis Rat, AA)臨床表現(xiàn)及病理學(xué)的改變與臨床RA患者相似,是一種復(fù)制方法簡便、可重復(fù)性強,成模率較高的理想RA動物模型。AA大鼠滑膜成纖維細胞(AA-FLS)較RA患者滑膜成纖維細胞(RA-FLS)更容易獲取,若可以將AA-FLS用作RA的體外研究,可在短期內(nèi)培養(yǎng)獲得大量細胞模型。因此,我們對AA-FLS的培養(yǎng)方法及細胞特性進行研究,綜合評價該細胞模型與RA患者滑膜成纖維細胞的相似性,探討其作為體外研究RA發(fā)病機制及抗RA藥物篩選的細胞模型的可行性。過山楓(Celastrus aculeatus Merr.)屬于衛(wèi)矛科(Celastraceae)南蛇藤屬植物,是我國民間風濕骨病的常用藥,主要功效為清熱解毒、活血止痛,祛風利濕常用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎等癥。我們之前的研究發(fā)現(xiàn),過山楓的乙醇提取物可以顯著抑制AA大鼠滑膜炎癥,同時對大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織及軟骨損傷具有保護作用。扁蒴藤素(Pristimerin, Pris)是過山楓有效部位提取物之一,一種天然的木栓烷型五環(huán)三萜類化合物,研究報道扁蒴藤素具有抗炎,抗腫瘤等活性,隨著對扁蒴藤素的研究發(fā)現(xiàn),扁蒴藤素能有效抑制多種腫瘤細胞的增殖。本課題組研究證實,扁蒴藤素能夠抑制RA滑膜炎癥和滑膜血管新生,具有明顯的抗RA作用。在前期研究的基礎(chǔ)上,我們以在體動物和細胞模型為觀察對象,研究了扁蒴藤素對AA大鼠模型和AA-FLS細胞模型的影響,探討扁蒴藤素對類風濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞增殖的作用,闡明其可能的分子機制。目的：1建立佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜成纖維細胞(AA-FLS)的培養(yǎng)方法并分析其生物學(xué)特性。2考察扁蒴藤素抑制佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠(AA大鼠)滑膜組織增生和佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜成纖維細胞(AA-FLS)增殖的藥效學(xué)作用。3闡明扁蒴藤素抑制AA-FLS增殖作用的分子機制。方法：1 AA-FLS原代培養(yǎng)及特征分析膠原酶法分離獲取AA-FLS細胞進行原代培養(yǎng),觀察各代細胞形態(tài)特征,免疫細胞化學(xué)方法鑒定細胞。CCK-8法檢測AA-FLS與正常大鼠FLS的增殖活性差異。ELISA測定細胞TNF-a和IL-1β的分泌水平。Hochest33258法考察細胞凋亡狀態(tài),Western Bolt檢測AA-FLS細胞線粒體凋亡通路重要調(diào)控蛋白Bcl-2和Bax及Pro-Caspase-3和Cleave-Caspase-3的表達水平。2扁蒴藤素對AA大鼠滑膜增生和AA-FLS增殖的抑制作用2.1動物水平佐劑型關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠模型制備：SD大鼠隨機分組后,除空白對照組外,其余各組大鼠于根尾部經(jīng)皮下一次性注射Mtb誘導(dǎo)劑制備AA大鼠模型。觀察記錄大鼠的一般體征,測定大鼠足體積變化,考察扁蒴藤素對AA大鼠關(guān)節(jié)腫脹的改善作用。2.2組織水平大鼠膝關(guān)節(jié)制作病理切片,通過HE染色觀察扁蒴藤素對滑膜細胞數(shù)量和滑膜組織增生等病理改變的影響作用。2.3細胞水平CCK-8法和臺盼藍拒染實驗檢測不同濃度扁蒴藤素對AA-FLS增殖抑制的作用。3扁蒴藤素對AA-FLS增殖抑制的作用機制3.1扁蒴藤素對AA-FLS細胞周期的影響用不同濃度的扁蒴藤素處理AA-FLS細胞后,通過流式細胞術(shù)對AA-FLS細胞周期進行分析,統(tǒng)計各組細胞周期分布比例的變化與差異,評價扁蒴藤素對AA-FLS細胞周期的作用影響。3.2扁蒴藤素誘導(dǎo)AA-FLS凋亡的作用采用Hoechst 33258染色的方法,對不同濃度扁蒴藤素干預(yù)后的AA-FLS進行染色,觀察各組熒光染色結(jié)果并計算細胞凋亡率,探討扁蒴藤素誘導(dǎo)AA-FLS凋亡的作用。3.3扁蒴藤素調(diào)控AA-FLS中線粒體凋亡通路蛋白水平的表達通過Western Blot的方法,檢測不同濃度扁蒴藤素對AA-FLS中Bcl-2、Bax和Pro-Caspase-3 、 Cleave-Caspase-3蛋白表達水平的影響。結(jié)果：1AA-FLS的原代培養(yǎng)及生物學(xué)特性1.1AA-FLS的原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)所得的細胞經(jīng)傳代純化后形態(tài)規(guī)則,呈典型梭形形態(tài),經(jīng)免疫細胞化學(xué)鑒顯示細胞vimentin表達呈陽性,CD68表達為陰性,結(jié)果表明分離所得為AA-FLS,原代培養(yǎng)成功。1.2 AA-FLS的生物特性(1) AA-FLS的增殖活性：細胞傳代培養(yǎng)第1---4d,AA-FLS和正常大鼠FLS均增殖緩慢；細胞傳代培養(yǎng)后第4d開始,AA-FLS增殖速度明顯高于正常大鼠FLS,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),AA-FLS細胞數(shù)量倍增所需的時間較正常大鼠FLS短,AA-FLS有較強的增殖活性。(2) AA-FLS細胞的炎性因子表達水平：AA-FLS與正常大鼠FLS相比,TNF-a和IL-1β的表達水平升高(P0.01)。(3) AA-FLS細胞凋亡率：AA-FLS細胞凋亡呈現(xiàn)明顯抑制狀態(tài),熒光顯微鏡下大多數(shù)細胞核呈彌散而微弱的藍色熒光,極少細胞核會出現(xiàn)亮藍色熒光,此結(jié)果表明AA-FLS極少細胞處于凋亡狀態(tài)。AA-FLS細胞凋亡率低于正常大鼠FLS的細胞凋亡率(P0.01)。(4) AA-FLS中線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白表達水平：AA-FLS中抗凋亡蛋白Bcl-2相對表達量增高,差異有顯著性(P0.01)；促凋亡蛋白Bax的表達量有下調(diào)趨勢,但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義；Pro-Caspase-3的相對表達量有所增高,但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義,此外本研究發(fā)現(xiàn)正常大鼠FLS中并不表達Cleave-Caspase-3 。通過實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),AA-FLS具有增殖活躍、凋亡抑制和分泌高水平細胞因子的特性。2扁蒴藤素抑制AA大鼠滑膜炎癥和滑膜組織增生實驗結(jié)果顯示,低劑量(0.40mg/kg)和高劑量(0.80mg/kg)的扁蒴藤素均能使AA大鼠的足趾容積減小,明顯減輕AA大鼠的足腫脹程度而改善病情,扁蒴藤素濃度越高時改善病情效果越明顯。大鼠膝關(guān)節(jié)的病理切片HE染色結(jié)果分析表明,低劑量和高劑量組的扁蒴藤素均能阻斷AA大鼠滑膜組織的炎性細胞浸潤,減少滑膜組織增生。3扁蒴藤素抑制AA-FLS細胞增殖扁蒴藤素能抑制AA-FLS的增殖,扁蒴藤素(0.75μM、1.5μM、3μM、5μM、10μM)作用后的AA-FLS,各組細胞活性顯著低于空白對照組(P0.01)；扁蒴藤素(0.75μM、1.5μM、3μM)干預(yù)后的AA-FLS細胞死亡率高于空白對照組細胞(P0.01)。扁蒴藤素能抑制AA-FLS增殖的作用具有劑量依賴性。4扁蒴藤誘導(dǎo)AA-FLS凋亡Hoechst33258實驗結(jié)果顯示,0.75μM～3μM濃度范圍的扁蒴藤素能夠誘導(dǎo)AA-FLS凋亡,隨著扁蒴藤素濃度的升高,細胞凋亡率也隨之升高,與空白對照組細胞相比有顯著性差異(P0.01)。5扁蒴藤素誘導(dǎo)AA-FLS細胞周期G0/G1期阻滯在0.75μM～3μM濃度范圍內(nèi),扁蒴藤素能使AA-FLS處于G0/G1期的細胞數(shù)量增多,處于S期的細胞數(shù)量減少,造成細胞周期G0/G1期阻滯。扁蒴藤素濃度越高,阻滯效果越明顯。6扁蒴藤素對線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白的作用對線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),扁蒴藤素能下調(diào)Bcl-2的表達,提高Bax的相對表達量,并呈劑量依賴關(guān)系。此外扁蒴藤素能促進AA-FLS中的Pro-Caspase-3蛋白剪切活化,增加Cleave-Caspase-3的表達量。提示扁蒴藤素能調(diào)節(jié)線粒體凋亡通路,從而誘導(dǎo)AA-FLS細胞凋亡。結(jié)論：本項研究基于Mtb誘導(dǎo)的AA大鼠模型和AA-FLS細胞模型,通過研究扁蒴藤素對兩種模型的作用,評價扁蒴藤素的抗RA作用,闡明相關(guān)藥理作用機制,通過實驗得出以下結(jié)論：1.建立了AA-FLS細胞模型,并在細胞模型上觀察了細胞增殖和凋亡作用,細胞因子分泌水平等。實驗結(jié)果表明該細胞模型與RA-FLS具有相似的特點,可以用于RA相關(guān)研究中。本實驗中探討扁蒴藤素對RA-FLS的作用是基于AA-FLS細胞模型完成的。2.扁蒴藤素顯著抑制AA-FLS增殖,減輕滑膜組織增生,從而達到抗RA的作用。3.扁蒴藤素抑制AA-FLS增殖的主要作用機制是誘導(dǎo)AA-FLS細胞周期的G0/G1期阻滯及誘導(dǎo)AA-FLS細胞凋亡。而扁蒴藤素誘導(dǎo)AA-FLS凋亡是通過調(diào)控抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表達,促進Pro-Caspase-3的剪切,增加促凋亡活性的Cleave-Caspase-3蛋白的表達來實現(xiàn)的。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R259

【參考文獻】

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本文編號：2477138