本文關(guān)鍵詞：鐵皮石斛中抗腫瘤活性物質(zhì)的分離純化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《華南理工大學(xué)》 2014年

鐵皮石斛中抗腫瘤活性物質(zhì)的分離純化

鄭秋平  

【摘要】：本文采用兩條研究路線對鐵皮石斛中的抗腫瘤活性物質(zhì)進行了分離純化：1.采用乙酸乙酯、95%乙醇和水三種不同極性的溶劑依次對鐵皮石斛莖的干燥粉末進行了提取，初步得到了三種提取物；初提取物在MTT細胞增殖檢測結(jié)果的指引下，結(jié)合硅膠柱層析、TLC薄層分析和凝膠柱層析進行分離純化，最終篩選出具有強抗腫瘤活性的組分，并結(jié)合質(zhì)譜、核磁（氫譜）及相關(guān)文獻對該化合物的結(jié)構(gòu)進行了鑒定。2.用硫酸銨沉淀法從鐵皮石斛的PBS提取液中制備出粗蛋白，再用堿性蛋白酶Alcalase2.4L、胰蛋白酶和堿性蛋白酶37017三種酶在各自給定的酶解條件下對鐵皮石斛粗蛋白進行酶解，酶解產(chǎn)物經(jīng)Sephedax G-25柱層析分成不同分子量的組份，隨后用MTT法篩選出抗腫瘤活性較好的組份，最后利用質(zhì)譜技術(shù)對篩選出的組分中多肽的序列進行鑒定，并合成之。本研究的主要成果如下： 1)乙酸乙酯提取物經(jīng)分離純化后得到強抗腫瘤活性物質(zhì)TD1和TD2，TD1對肝癌細胞HepG-2、胃癌細胞SGC-7901和乳腺癌細胞MCF-7的半抑制濃度IC50分別為：0.45μg/mL、0.36μg/mL、0.34μg/mL，抗腫瘤作用要明顯強于TD2和陽性對照。隨后結(jié)合質(zhì)譜、核磁（氫譜）及相關(guān)文獻比對TD1和TD2的化學(xué)結(jié)構(gòu)進行鑒定，其結(jié)果為：TD1為金叉石斛菲醌(denbinobin)，該化合物是鐵皮石斛中重要的抗腫瘤物質(zhì)，其抗腫瘤活性已得到廣泛的研究和認可，有望成為新的抗腫瘤藥物。TD2為柚皮素(Naringenin)，該化合物是一種廣譜抗腫瘤化合物，不僅可以直接抑制腫瘤細胞的增殖，還可以增強其它抗腫瘤藥物的效果，有重要的研究價值。但是在研究TD1和TD2對正常肝細胞L-O2的細胞毒性的實驗中發(fā)現(xiàn)，TD1和TD2對L-O2的IC50分別是：2.12μg/mL和8.34μg/mL，由此可見它們在殺死癌細胞的同時也會損害正常細胞，因此要想開發(fā)以TD1和TD2為原料的抗腫瘤藥物還有很長的路要走。 2)鐵皮石斛粗蛋白的堿性蛋白酶Alcalase2.4L酶解產(chǎn)物經(jīng)Sephedax G-25純化后得到的A3組份，不僅分子量較低，而且多肽含量高，達到99.2%，還對胃癌細胞SGC-7901有明顯的抑制作用，因此選擇A3進行下一步研究。研究發(fā)現(xiàn)A3對肝癌細胞HepG-2、胃癌細胞SGC-7901和乳腺癌細胞MCF-7都有一定的抑制作用，半抑制濃度IC50分別為：169.62μg/mL、155.20μg/mL、107.53μg/mL，A3對MCF-7的抑制效果要明顯好于其它兩種癌細胞，且在濃度為1000μg/mL時對正常肝細胞L-O2的增殖沒有抑制作用。 3)對A3一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析后決定對占峰面積百分比較大的三個多肽(荷質(zhì)比分別為：1417.840、2994.743和1504.81)進行測序和合成。測序結(jié)果(C→N)： P1(RHPFDGPLLPPGD)、P2(KPEEVGGAGDRWTC)和P3(RCGVNAFLPKSYLVHFGWKLLFHFD)。合成這三個多肽之后，利用HPLC和MS對它們的純度和分子量進行了檢測，合成肽的純度均在98%以上，分子量理論分子量的差距均在0.1%以內(nèi)。 4)利用MTT法檢測合成肽的抗腫瘤活性后發(fā)現(xiàn)：合成肽對肝癌細胞HepG-2、胃癌細胞SGC-7901和乳腺癌細胞MCF-7都沒有表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性，這與A3的抗腫瘤活性相差甚遠，同時合成多肽對正常肝細胞L-O2也沒有表現(xiàn)出明顯的抑制作用。據(jù)分析這些差異可能是由于多肽的空間結(jié)構(gòu)改變，合成的多肽不穩(wěn)定等原因造成的，具體情況有待進一步研究。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R284.2
【目錄】：

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3 戴燕萍;鐵皮石斛生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范研究[D];浙江農(nóng)林大學(xué);2012年

4 王俊潔;鐵皮石斛體細胞無性變異的生藥學(xué)初步研究[D];云南中醫(yī)學(xué)院;2012年

5 李東賓;冷脅迫下鐵皮石斛抗寒基因的克隆與表達研究[D];浙江農(nóng)林大學(xué);2013年

6 郭洪波;鐵皮石斛（Dendrobium candidum）組培快繁及其抗癌作用的研究[D];沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

7 李霖明;鐵皮石斛菌根化育苗及重引入技術(shù)研究[D];海南大學(xué);2011年

8 徐琳娜;茂蘭喀斯特鐵皮石斛環(huán)境適應(yīng)性研究[D];貴州師范大學(xué);2008年

9 朱波;鐵皮石斛人工雜交技術(shù)與優(yōu)良家系苗期選擇[D];浙江農(nóng)林大學(xué);2011年

10 苑鶴;鐵皮石斛主要活性成分遺傳變異規(guī)律研究[D];浙江農(nóng)林大學(xué);2011年

  本文關(guān)鍵詞：鐵皮石斛中抗腫瘤活性物質(zhì)的分離純化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：116416