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《陜西師范大學(xué)》 2014年

甘草總提物及甘草酸、甘草次酸對P-糖蛋白和藥物代謝酶的影響

虎虓虓  

【摘要】：中藥甘草(Radix Glycyrrhiza)是豆科植物甘草的干燥根和根莖,依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論,甘草性平味甘,歸十二經(jīng),為藥中“國老”。其藥理作用顯著且廣泛,如解毒、解痙、止痛、祛痰、抗癌等。由于具有“調(diào)和諸藥”的功效,甘草被廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)中藥的各種復(fù)方中,以至于有了“十方九草”的說法。 已有研究表明甘草可通過調(diào)節(jié)肝臟CYP3A酶,誘導(dǎo)毒物代謝。同時(shí)有研究指出P-糖蛋白參與了甘草的解毒機(jī)制。P-糖蛋白作為細(xì)胞膜上的一種藥物外排泵,負(fù)責(zé)將其底物主動轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞,既然是主動運(yùn)輸,即決定了它的ATP依賴性。P-糖蛋白的外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)功能若受到誘導(dǎo),則有可能促進(jìn)機(jī)體對于有毒物質(zhì)的外排,實(shí)現(xiàn)保護(hù)機(jī)體的目的。而肝臟代謝是毒物在體內(nèi)的清除途徑之一,這是一個(gè)需要多種藥物代謝酶參與催化的過程。比如肝細(xì)胞色素P450酶系(Cytochrome P450, CYP450)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-s-transferase, GST)即可參與催化大多數(shù)藥物在機(jī)體的代謝,故可通過調(diào)節(jié)其含量及活性以達(dá)到減毒增效的效果。 因此,我們選擇甘草總提物和甘草的主要活性成分甘草酸、甘草次酸作為實(shí)驗(yàn)藥物,研究其對Caco-2細(xì)胞膜上P-糖蛋白的功能及表達(dá),以及對HepG2細(xì)胞中CYP3A4、GSTs藥物代謝酶的影響,以期探究甘草對P-糖蛋白和藥物代謝酶可能存在的潛在調(diào)控機(jī)制。 主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下： 1.采用MTT比色法進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示甘草酸的濃度不大于40gM,甘草次酸的濃度不大于20μM,甘草總提物的濃度不大于10μg/mL時(shí)均對Caco-2細(xì)胞的生長抑制率≤20%,為非細(xì)胞毒性濃度；當(dāng)甘草酸濃度不超過20μM,甘草次酸的濃度不超過10μM,甘草總提物的濃度不超過40μg/mL時(shí),均對HepG2細(xì)胞的生長抑制率≤20%,因此為非細(xì)胞毒性濃度。故選取甘草酸的濃度梯度為1.6μM、8μM、40μM,甘草次酸的濃度梯度為20μM,甘草總提物的濃度梯度為0.4μg/mL、2μg/mL、10μg/mL,以進(jìn)行下一步P-糖蛋白部分的研究。藥物代謝酶部分的研究則選取甘草酸的濃度梯度為0.8μM、2μM、10μM甘草次酸的濃度梯度為0.4μM、2μM.10μM,甘草總提物的濃度梯度為1.6μg/mL、8μg/mL、40μg/mL 2.藥物對P-糖蛋白功能的影響研究,阿霉素蓄積實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對照組Caco-2細(xì)胞中阿霉素?zé)晒庀鄬?qiáng)度(MFI)為12.54,陽性對照組細(xì)胞內(nèi)該值為19.96；而細(xì)胞經(jīng)低、中、高濃度組的甘草酸處理后,胞內(nèi)阿霉素MFI分別為9.85、9.06、8.84；細(xì)胞經(jīng)甘草次酸處理后阿霉素MFI為9.56、9.15、8.82；濃度梯度的甘草總提物處理細(xì)胞后,胞內(nèi)阿霉素MFI分別為8.61、7.88、7.52。羅丹明123蓄積實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Caco-2細(xì)胞經(jīng)低、中、高濃度組的甘草酸處理后,胞內(nèi)羅丹明123熒光相對強(qiáng)度(MFI)分別為27.99、19.89、13.6;甘草次酸組的Caco-2細(xì)胞內(nèi)該值為29.02、20.68、12.29；細(xì)胞經(jīng)梯度濃度的甘草總提物處理后,胞內(nèi)MFI為23.55、20.75、15.35；空白對照組及陽性對照組細(xì)胞內(nèi)羅丹明123MFI分別為28.9和42.68。羅丹明123外排實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示Caco-2細(xì)胞經(jīng)低、中、高濃度組的甘草酸處理后,胞內(nèi)羅丹明123MFI分別為19.24、15.34、13.56；甘草次酸組的Caco-2細(xì)胞內(nèi)該值為18.2、15.07、12.9；細(xì)胞經(jīng)梯度濃度的甘草總提物處理后,胞內(nèi)MFI為17.28、13.2、10.67；空白對照組及陽性對照組細(xì)胞內(nèi)羅丹明123MFI分別為18.3和36.68。這一系列數(shù)據(jù)顯示甘草總提物及甘草酸、甘草次酸不僅能有效抑制Caco-2細(xì)胞中P-糖蛋白底物阿霉素和羅丹明123的蓄積,亦能顯著誘導(dǎo)羅丹明123的外排(P0.05、P0.01或P0.001),且具有濃度效應(yīng)。 3.結(jié)合半定量RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測藥物對P糖蛋白ABCB1基因的表達(dá)調(diào)控。半定量RT-PCR結(jié)果顯示,甘草酸、甘草次酸和甘草總提物均能上調(diào)Caco-2細(xì)胞內(nèi)ABCB1基因的轉(zhuǎn)錄水平。對照組細(xì)胞內(nèi)ABCB1灰度值／β-actin灰度值之比為7.3%,經(jīng)低、中、高濃度的甘草酸處理后,比值升高為8.5%、9.7%、10.7%；細(xì)胞經(jīng)甘草次酸處理后,灰度比升高為21.1%、22.9%、30.4%；經(jīng)甘草總提物處理后,灰度比值為20.5%、24.4%、35.7%。實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果與半定量RT-PCR結(jié)果基本一致,經(jīng)藥物處理后細(xì)胞內(nèi)ABCB1基因mRNA的表達(dá)水平比未處理組顯著升高(P0.05、P0.01),且甘草酸和甘草次酸的中、高濃度組及甘草總提物的低、中、高濃度組均呈現(xiàn)出濃度依賴性,表明實(shí)驗(yàn)藥物對細(xì)胞內(nèi)P-糖蛋白ABCB1基因的轉(zhuǎn)錄具有誘導(dǎo)效應(yīng)。 4.結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光法檢測藥物對P-糖蛋白表達(dá)的調(diào)控,結(jié)果表明Caco-2細(xì)胞經(jīng)低、中、高濃度組甘草酸處理后,細(xì)胞膜上P-糖蛋白表達(dá)量分別為11.91、12.27、13.19；經(jīng)梯度濃度的甘草次酸處理后,該值分別為12.12、12.49、13.48；甘草總提物組的P-糖蛋白表達(dá)量的檢測結(jié)果為13.0、13.69、15.15；空白對照組的值為7.33。數(shù)據(jù)顯示甘草酸、甘草次酸及甘草總提物均能夠顯著誘導(dǎo)P-糖蛋白的表達(dá)(P0.05),且具有劑量效應(yīng)。 5.藥物對P-gp ATPase活性的影響研究,結(jié)果表明Caco-2細(xì)胞經(jīng)梯度濃度的甘草酸、甘草次酸和甘草總提物處理后,P-gp ATPase酶活分別為3.25、10.47、15.33U/mgprot;3.31、12.45、25.62U/mgprot;3.38、13.67、21.44U/mgprot;對照組P-gp ATPase酶活為3.12U/mgprot。數(shù)據(jù)顯示,中、高濃度組的甘草酸、甘草次酸和甘草總提物均可誘導(dǎo)P-gpATPase的活性(P0.01或P0.001),提示它們可能以此促進(jìn)ATP的水解,保證對P-糖蛋白的供能,從而實(shí)現(xiàn)甘草對其外排功能的促進(jìn)。 6.通過對HepG2細(xì)胞中CYP450亞酶CYP3A4和GSTs酶活的檢測,結(jié)果顯示HepG2細(xì)胞經(jīng)梯度濃度的甘草酸、甘草次酸和甘草總提物處理后,細(xì)胞中CYP3A4酶活分別為1.59、1.56、1.51nmol/mg. min;1.58、1.49、1.38nmol/mg· min;1.31、2.14、2.37nmol/mg·min;對照組值為1.75nmol/mg·min。而細(xì)胞中GSTs酶活分別為3.91、6.94、9.61U/mgprot;9.09、12.34、13.63U/mgprot;13.66、16.62、22.17U/mgprot;空白對照組的GSTs酶活為3.97U/mgprot。由此表明甘草酸、甘草次酸的低、中、高劑量,以及低劑量的甘草總提物均能抑制CYP3A4的酶活,且有顯著性差異。而甘草總提物的中、高劑量組則能顯著誘導(dǎo)CYP3A4活性(P0.01)。甘草酸、甘草次酸和甘草總提物均能顯著上調(diào)GST酶活性(P0.05或P0.01),同時(shí)具有濃度效應(yīng)。與甘草酸和甘草次酸相比,甘草總提物對GST酶活的誘導(dǎo)效應(yīng)最為顯著。 結(jié)論：甘草酸、甘草次酸和甘草提取物均可通過上調(diào)Caco-2細(xì)胞膜上P-糖蛋白ABCB1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平,以及有效誘導(dǎo)P-gp ATPase酶活以保證對P-糖蛋白的能量供應(yīng),從而促進(jìn)了P-糖蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。因此推測甘草酸和甘草次酸可能是甘草誘導(dǎo)P-糖蛋白外排功能,從而促進(jìn)P-pg介導(dǎo)的胞內(nèi)毒物外排的主要成分。中、高濃度的甘草總提物能夠顯著增強(qiáng)藥物代謝Ⅰ相酶CYP3A4的酶活(P0.01),而甘草酸和甘草次酸則濃度依賴性的抑制CYP3A4的活性。推測甘草酸和甘草次酸并非甘草誘導(dǎo)CYP3A4活性的主要成分,而甘草作為CYP3A4的誘導(dǎo)劑,可能與其解毒作用有關(guān)。對于藥物代謝Ⅱ相酶GSTs而言,甘草酸、甘草次酸和甘草總提物均能誘導(dǎo)其活性。本實(shí)驗(yàn)的研究成果可能為甘草解毒機(jī)制的研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R285
【目錄】：

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【相似文獻(xiàn)】

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1 雍建平;張毓洪;;18β-甘草次酸結(jié)構(gòu)的量子化學(xué)計(jì)算[J];時(shí)珍國醫(yī)國藥;2011年04期

2 趙龍鉉;張曉翠;趙春暉;沈平;楊君微;唐堯;;甘草次酸衍生物的合成與表征[J];大連大學(xué)學(xué)報(bào);2011年03期

3 李紅,郭玉,廖端芳,袁滿紅;甘草次酸抑制兔準(zhǔn)分子激光角膜切削術(shù)后角膜上皮下混濁的作用[J];中國藥理學(xué)通報(bào);2004年03期

4 劉文叢;羅云清;鄭友蘭;張崇禧;;乙酰甘草次酸甲酯的合成與表征[J];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2008年03期

5 木合布力·阿布力孜;閔杰;鄭大成;馬紅艷;熱娜·卡斯木;;11-脫氧18α-和18β-甘草次酸類抗癌復(fù)合物的制備和結(jié)構(gòu)表征[J];天然產(chǎn)物研究與開發(fā);2012年05期

6 王軍;胡小麗;文偉河;楊雷雷;朱玉亮;;甘草次酸3位氨基酸衍生物的合成及其抑菌活性[J];應(yīng)用化學(xué);2012年08期

7 彭子模;甘草次酸及其衍生物的研究現(xiàn)狀和展望[J];中醫(yī)藥學(xué)報(bào);1998年01期

8 謝輝;18β-甘草次酸的研究進(jìn)展[J];中成藥;2002年09期

9 程小平,樊靜維,龐捷;實(shí)驗(yàn)室制取甘草次酸賴氨酸鹽的方法和體會[J];青海醫(yī)藥雜志;2004年01期

10 湯立達(dá);王建武;雍建平;張士俊;劉利軍;王玉麗;吳楠;徐為人;;新型11-脫氧甘草次酸-30-酰胺衍生物的研究[J];中草藥;2006年01期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 祁小燕;張志雄;;甘草次酸對缺血豚鼠心室肌細(xì)胞動作電位的影響[A];中國生理學(xué)會第21屆全國代表大會暨學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2002年

2 張鳳云;岳保珍;賀師鵬;;甘草次酸的新生物學(xué)作用[A];中國藥理學(xué)會第八次全國代表大會暨全國藥理學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2002年

3 田秦;王秀華;王蔚;袁直;;甘草次酸修飾殼聚糖/聚乙二醇納米粒子的制備及其肝靶向性研究[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會第30次學(xué)術(shù)年會暨生物醫(yī)學(xué)工程前沿科學(xué)研討會論文集[C];2010年

4 顏苗;李蘭芳;李煥德;許丹華;劉艷文;;甘草次酸18位差向異構(gòu)體對Caco-2細(xì)胞P-糖蛋白功能和表達(dá)的影響[A];2010年中國藥學(xué)大會暨第十屆中國藥師周論文集[C];2010年

5 周能;梁逸曾;王平;陳憲;;甘草次酸與血清白蛋白的結(jié)合與其藥理意義[A];中國化學(xué)會第二十五屆學(xué)術(shù)年會論文摘要集（下冊）[C];2006年

6 張鳳云;岳保珍;賀師鵬;;甘草次酸對大鼠血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響[A];第三屆全國現(xiàn)代生物物理技術(shù)學(xué)術(shù)討論會論文摘要匯編[C];2000年

7 沙磊;龍文艷;張奕華;賴宜生;;新型11-脫氧甘草次酸衍生物的合成及抗腫瘤活性研究[A];2011年全國藥物化學(xué)學(xué)術(shù)會議——藥物的源頭創(chuàng)新論文摘要集[C];2011年

8 王志琪;曾嶸;田育望;王蓓;李鑫;陳立峰;;附子與甘草配伍前后烏頭堿和甘草次酸在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)比較[A];全國中藥藥理學(xué)會聯(lián)合會學(xué)術(shù)交流大會論文摘要匯編[C];2012年

9 張鳳云;岳保珍;賀師鵬;;甘草次酸是AT_1受體的激動劑[A];第九次全國生物物理大會學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2002年

10 吳紅金;;甘草次酸對心臟鈉離子通道電流的影響[A];2010中國醫(yī)師協(xié)會中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)師大會摘要集[C];2010年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 記者胡德榮;[N];健康報(bào);2010年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 彭維兵;四種新型18β-甘草次酸和齊墩果酸修飾物成藥性的初步評價(jià)[D];中國海洋大學(xué);2010年

2 涂江華;甘草酸對CYP450酶的影響及其機(jī)制研究[D];中南大學(xué);2010年

3 何子雙;甘草次酸對新生仔豬生長的影響及其機(jī)理研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

4 辛秀蘭;穿心蓮系列化合物及甘草次酸的生物轉(zhuǎn)化研究[D];北京化工大學(xué);2009年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 徐靜;甘草次酸及乙酰甘草次酸的制備和純化研究[D];蘭州理工大學(xué);2011年

2 吳楠;甘草次酸衍生物藥效學(xué)篩選及相關(guān)機(jī)制的探討[D];天津醫(yī)科大學(xué);2006年

3 趙德千;齊墩果酸和甘草次酸衍生物的合成與表征及其抗菌和抗癌活性的研究[D];遼寧師范大學(xué);2010年

4 曹姍;口服甘草次酸急性毒性、體內(nèi)分布及對血清離子元素含量影響的研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2012年

5 杜銳;生物法耦合膜技術(shù)制備甘草次酸的研究[D];湖北工業(yè)大學(xué);2008年

6 張寶喜;甘草次酸衍生物的合成及大孔吸附樹脂純化補(bǔ)腎益壽膠囊的工藝研究[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2011年

7 劉文叢;甘草酸及甘草次酸衍生物的研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

8 高苗苗;甘草次酸抗癌復(fù)合物及查爾酮類化合物的合成和抗癌活性研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2013年

9 馬淑燕;甘草有效成分的制備及甘草次酸類肝靶向抗癌前藥的合成研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2008年

10 張曉翠;齊墩果酸和甘草次酸衍生物的合成與表征及其抗菌活性研究[D];遼寧師范大學(xué);2012年

  本文關(guān)鍵詞：甘草總提物及甘草酸、甘草次酸對P-糖蛋白和藥物代謝酶的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：107970