肝纖維化是因致病因子長期刺激導(dǎo)致肝臟受損,以細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)過度沉積、結(jié)締組織異常增生為主要特點的肝臟結(jié)構(gòu)和功能異常的病理過程。肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)是ECM的主要來源。NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)家族的主要功能是催化產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS),導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生,HSC中主要表達NOX1、NOX2、NOX4。肝臟是過量ROS主要攻擊的器官,導(dǎo)致氧化破壞,釋放大量炎癥因子,同時直接刺激HSC活化,導(dǎo)致纖維化。β-arrestin2是arrestin家族成員之一,是G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)的調(diào)節(jié)蛋白,參與受體的脫敏和內(nèi)化。研究發(fā)現(xiàn),它還可以調(diào)節(jié)許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,影響ECM的沉積、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等,參與纖維化疾病進程。課題組前期研究結(jié)果表明,β-arrestin2在肝纖維化患者肝臟中的表達明顯高于肝內(nèi)膽管結(jié)石患者;體外使用β-arrestin2 siRNA轉(zhuǎn)染HSC,可抑制...

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
英文縮略詞表
摘要
ABSTRACT
1 前言
2 實驗材料
    2.1 實驗動物
    2.2 細胞株
    2.3 試劑
    2.4 儀器與設(shè)備
3 實驗方法
    3.1 β-arrestin2基因敲除對CCl₄誘導(dǎo)的小鼠氧化應(yīng)激和肝纖維化的影響及CP-25的作用
        3.1.1 CCl₄誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型的建立與分組
        3.1.2 肝臟組織病理學(xué)檢查
        3.1.3 DHE熒光探針檢測小鼠肝臟冰凍切片ROS表達
        3.1.4 免疫熒光雙染法檢測小鼠肝臟中β-arrestin2、NOX4的表達情況
        3.1.5 Western blot法檢測NOX4、膠原、β-arrestin2、MMP-13、TIMP-1表達的變化
        3.1.6 免疫組化法檢測NOX4、膠原在肝纖維化小鼠肝臟中的表達情況
    3.2 NOX4 siRNA對LX-2細胞中氧化應(yīng)激及纖維化指標表達的影響
        3.2.1 LX-2細胞的培養(yǎng)
        3.2.2 LX-2細胞總蛋白的提取和定量
        3.2.3 Western blot法檢測不同濃度AngⅡ刺激對NOX4、α-SMA蛋白表達影響
        3.2.4 NOX4 siRNA的篩選和轉(zhuǎn)染效率驗證
        3.2.5 NOX4 siRNA對LX-2中氧化應(yīng)激及纖維化指標表達的影響
    3.3 β-arrestin2 siRNA對LX-2細胞中纖維化指標及下游信號通路相關(guān)蛋白表達的影響
        3.3.1 實驗分組
        3.3.2 Western blot法檢測β-arrestin2、Ⅰ型膠原、NOX4、p-ERK、p-JNK蛋白表達的變化
    3.4 CP-25對LX-2中ROS及纖維化相關(guān)蛋白表達的影響
        3.4.1 實驗分組
        3.4.2 CP-25對LX-2細胞ROS表達的影響
        3.4.3 Westernblot法檢測CP-25對NOX4、Ⅰ型膠原蛋白和β-arrestin2表達的影響
    3.5 統(tǒng)計學(xué)處理
4 結(jié)果
    4.1 β-arrestin2基因敲除對CCl₄誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化和氧化應(yīng)激的影響
        4.1.1 β-arrestin2基因敲除對CCl₄誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝臟外觀和病理的影響
        4.1.2 β-arrestin2基因敲除對CCl₄誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝臟ROS產(chǎn)生的影響
        4.1.3 肝纖維化小鼠肝組織β-arrestin2、NOX4的表達情況
        4.1.4 β-arrestin2基因敲除對CCl₄誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝臟中NOX4、膠原表達的影響
        4.1.5 β-arrestin2基因敲除對CCl₄誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝臟中MMP-13、TIMP-1表達的影響
    4.2 CP-25對CCl₄誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的影響
        4.2.1 免疫組化檢測CP-25對CCl₄誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝臟中NOX4和膠原表達的影響
        4.2.2 CP-25對CCl₄誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝臟NOX4、Ⅲ型膠原和β-arrestin2表達的影響
        4.2.3 CP-25對CCl₄誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝臟MMP-13和TIMP-1表達的影響
    4.3 NOX4 siRNA對LX-2細胞中氧化應(yīng)激及纖維化指標表達的影響
        4.3.1 不同濃度AngⅡ刺激對LX-2細胞中NOX4、α-SMA表達的影響
        4.3.2 NOX4 siRNA篩選與轉(zhuǎn)染效率驗證
        4.3.3 NOX4 siRNA對AngⅡ刺激的LX-2細胞ROS產(chǎn)生的影響
        4.3.4 NOX4 siRNA對AngⅡ刺激的LX-2細胞Ⅰ型膠原蛋白表達的影響
    4.4 β-arrestin2 siRNA對AngⅡ刺激得LX-2細胞中纖維化指標及下游信號通路相關(guān)蛋白表達的影響
        4.4.1 β-arrestin2 siRNA轉(zhuǎn)染效率驗證
        4.4.2 β-arrestin2 siRNA對AngⅡ刺激的LX-2細胞ROS產(chǎn)生的影響
        4.4.3 β-arrestin2 siRNA對AngⅡ刺激的LX-2細胞Ⅰ型膠原和NOX4蛋白表達的影響
        4.4.4 β-arrestin2 siRNA對AngⅡ刺激的LX-2細胞中ERK和 JNK激活的影響
    4.5 CP-25對LX-2細胞中氧化應(yīng)激及纖維化指標表達的影響
        4.5.1 CP-25對LX-2細胞ROS表達的影響
        4.5.2 CP-25對AngⅡ刺激的LX-2細胞中β-arrestin2、NOX4和Ⅰ型膠原蛋白表達的影響
5 討論
    5.1 氧化應(yīng)激在肝纖維化發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用
    5.2 β-arrestin2可能通過上調(diào)NOX4介導(dǎo)氧化應(yīng)激
    5.3 CP-25可能通過下調(diào)β-arrestin2降低NOX4和ROS的生成發(fā)揮抗肝纖維化作用
6 結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝
綜述：G蛋白偶聯(lián)受體與肝損傷的研究進展
    參考文獻



本文編號：3745996