目的基于蛋白質(zhì)、肽類物質(zhì)組成及修飾組成的變化,研究砂炒炮制對(duì)穿山甲物質(zhì)基礎(chǔ)的影響。方法采用Nano LC-MS/MS對(duì)炮制前后穿山甲蛋白質(zhì)、肽類組成及變化進(jìn)行分析鑒定,對(duì)鑒定的蛋白質(zhì)、肽類發(fā)生的脫酰胺修飾與氧化修飾進(jìn)行比較。結(jié)果穿山甲主要由角蛋白、連接蛋白、橋粒蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白及促進(jìn)角質(zhì)致密結(jié)構(gòu)形成的異構(gòu)酶類組成。穿山甲經(jīng)炮制后,可溶性蛋白質(zhì)、肽類的鑒定數(shù)量未見(jiàn)明顯變化,難溶性蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量顯著降低;炮制后蛋白質(zhì)、肽類的脫酰胺修飾數(shù)量顯著增加;炮制后I型、II型角蛋白的鑒定肽段數(shù)量顯著增加,Asn與Gln發(fā)生脫酰胺修飾的數(shù)量顯著增加;穿山甲炮制前后鑒定肽段的相對(duì)分子質(zhì)量分布及親疏水性無(wú)顯著變化。結(jié)論盡管炮制會(huì)降低穿山甲整體蛋白質(zhì)鑒定的數(shù)量,但可顯著增加角蛋白的鑒定肽段數(shù)量,可顯著提高蛋白質(zhì)、肽類成分的脫酰胺修飾數(shù)量。結(jié)果提示炮制過(guò)程有利于角蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白的蛋白質(zhì)、肽類成分的溶出與釋放。為穿山甲物質(zhì)基礎(chǔ)研究,炮制對(duì)角質(zhì)類動(dòng)物藥物質(zhì)基礎(chǔ)的影響研究等提供依據(jù),也為穿山甲替代資源尋找與評(píng)價(jià)提供研究思路與方法。 

【文章來(lái)源】：中草藥. 2020,51(13)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：8 頁(yè)

【部分圖文】：

穿山甲中鑒定的蛋白質(zhì)、肽段韋恩圖

穿山甲主要含有角質(zhì)類成分，提取方法參照前期研究[12]，稍作改動(dòng)。提取流程如圖1所示，取穿山甲樣品（MS-1～MS-3）、炮山甲樣品（PMS-1～PMS-3）各10 mg，每個(gè)樣品加入1 mL提取液（含4%SDS,20 mmol/L DTT的Tris緩沖液），在65℃水浴孵育過(guò)夜，10 000 r/min離心10 min，取上清液為穿山甲提取液，沉淀部分重復(fù)上述提取步驟2次，將3次提取液合并，分別為穿山甲提取液（MSs-1～MSs-3）與炮山甲提取液（PMSs-1～PMSs-3），沉淀部分用PBS反復(fù)洗滌3次，分別為穿山甲渣（MSp-1～MSp-3）與炮山甲渣（PMSp-1～PMSp-3）。測(cè)定穿山甲提取液樣品（MSs-1～MSs-3、PMSs-1～PMSs-3）蛋白質(zhì)量濃度，每個(gè)樣品中取200μg蛋白質(zhì)總量的提取液，分別加入3倍體積的丙酮，至于-20℃靜置4 h后，10 000 r/min離心10min，棄去上清，用丙酮洗滌1次，揮干丙酮。加入200μL裂解液（含8 mol/L尿素的Tris緩沖液，pH 8）充分溶解蛋白后，加入pH 8的Tris緩沖液1 400μL稀釋，按質(zhì)量百分比加入1%胰蛋白酶，置于37℃水浴孵育過(guò)夜；穿山甲渣樣品（MSp-1～MSp-3、PMSp-1～PMSp-3）用pH 8的Tris緩沖液混懸，扣除提取液中蛋白質(zhì)總量后，按質(zhì)量百分比加入1%胰蛋白酶，置于37℃水浴孵育過(guò)夜。穿山甲提取液酶解樣品與穿山甲渣酶解樣品脫鹽，干燥，純水復(fù)溶后測(cè)定多肽總量，取20μg多肽溶液，再次干燥后用初始流動(dòng)相復(fù)溶至多肽質(zhì)量濃度為1μg/μL，待進(jìn)樣。

以I型角蛋白炮制前后的變化為例說(shuō)明脫酰胺位點(diǎn)、肽段數(shù)量、PSM及肽段序列的差異。如圖3所示，紫色箭頭表示炮制后的I型角蛋白較炮制前新出現(xiàn)的脫酰胺修飾位點(diǎn)，包括Gln75、Asn80、Asn101、Gln178、Gln203與Gln336。以胰蛋白酶酶切后形成的肽段GDLERQNQEYQVLLDVR為例，在炮制前的樣品中，僅測(cè)到GDLERQNQEYQVLLD VR與GDLERQNQEYQ(+0.98)VLLDVR 2條肽段；而炮制后的樣品中，測(cè)到了序列相同但是含有不同脫酰胺修飾的肽段共7個(gè)，除了炮制前檢測(cè)到的肽段GDLERQNQEYQVLLDVR與GDLERQNQEYQ(+0.98)VLLDVR外，還包括GDLERQN(+0.98)QE YQVLLDVR、GDLERQ(+0.98)NQEYQVLLDVR、GDLERQ(+0.98)N(+0.98)QEYQVLLDVR、GDLER Q(+0.98)NQ(+0.98)EYQVLLDVR與GDLERQ(+0.98)NQEYQ(+0.98)VLLDVR，分別在Gln334、Asn335、Gln336及Gln339發(fā)生了不同組合的脫酰胺修飾。如圖3-C所示，比較MS/MS圖譜可以看出，根據(jù)b離子或y離子的偏差，可準(zhǔn)確計(jì)算出脫酰胺修飾的位點(diǎn)，序列GDLERQNQEYQVLLDVR的b5+、b6+、b7+、b8+、b9+分別為571.29、699.34、813.39、941.44、1 070.49；而序列GDLERQ(+0.98)NQ(+0.98)EYQVLLDVR的b5+、b6+、b7+、b8+、b9+分別為571.29、700.33、814.37、943.41、1 072.46，兩者（b6+-b5+）值分別為128.05與129.04，表明肽段的6位Gln發(fā)生了修飾，兩者（b7+-b6+）值相同，表明7位Asn未發(fā)生修飾，（b8+-b7+）值分別為128.05與129.04，則表明8位Gln也發(fā)生了修飾，從而明確脫酰胺修飾的位點(diǎn)。圖3結(jié)果表明炮制后角蛋白修飾數(shù)量顯著增加，相同氨基酸序列上發(fā)生不同位點(diǎn)修飾使得肽段鑒定數(shù)量也明顯增加。2.6 穿山甲肽段相對(duì)分子質(zhì)量與親疏水性分布的對(duì)比分析

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]HPLC法同時(shí)測(cè)定穿山甲炮制品中3個(gè)主要環(huán)二肽成分的含量[J]. 劉遜,龐博文,王亞瓊,汪明志,吳芝遠(yuǎn),劉陽(yáng),張華鋒.  藥物分析雜志. 2019(08)
[2]不同炮制火候?qū)ι俺创┥郊仔誀詈铜h(huán)二肽類成分的影響[J]. 劉遜,汪明志,吳芝園,龐博文,張華鋒,王亞瓊.  中藥材. 2019(04)
[3]穿山甲高溫砂炒炮制增效機(jī)制研究[J]. 劉遜,劉睿,趙呈雷,吳芝園,朱曄,談如藍(lán),劉競(jìng)天,張迪.  中草藥. 2019(07)
[4]基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)-蛋白質(zhì)組學(xué)-多肽組學(xué)整合關(guān)聯(lián)分析策略的動(dòng)物藥蛋白多肽類成分研究思路及方法[J]. 楊彬,高文遠(yuǎn),張艷軍.  中草藥. 2019(05)
[5]中藥穿山甲的DNA分子鑒定研究[J]. 尹艷,劉遜,王兵,高琳惠,張夏楠.  中國(guó)中藥雜志. 2017(11)
[6]4種不同基原穿山甲炮制品的鑒定[J]. 劉遜,張華峰,劉雪梅,朱纓,崔小兵.  中藥材. 2017(03)
[7]四種穿山甲屬動(dòng)物的生藥學(xué)研究[J]. 吳芝園,巢建國(guó),劉遜.  現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐. 2015(02)
[8]穿山甲應(yīng)用及炮制研究進(jìn)展[J]. 王妍,張國(guó)民,哈偉.  中國(guó)現(xiàn)代中藥. 2015(03)
[9]角蛋白的分子構(gòu)成、提取及應(yīng)用[J]. 賈如琰,何玉鳳,王榮民,李芳蓉,王艷.  化學(xué)通報(bào). 2008(04)



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