中藥在我國醫(yī)藥產業(yè)的地位舉足輕重,《中醫(yī)藥創(chuàng)新發(fā)展規(guī)劃綱要（2006-2020年）》中明確提出,支持中藥材珍稀瀕危品種保護、繁育和替代品的研究。為開發(fā)名貴中藥熊膽的人工替代品,科技部經(jīng)過反復考察論證,立項重大新藥創(chuàng)制“體外培育熊膽粉關鍵技術及臨床前研究”（2014ZX09301306）。熊膽成分復雜,其中具有藥學價值的主要成分為熊去氧膽酸,是通過腸道微生物中7α-羥基類固醇脫氫酶（7α-HSDH）和7β-羥基類固醇脫氫酶（7β-HSDH）,以鵝去氧膽酸為底物轉化而來。黑熊作為能夠大量產生熊去氧膽酸的特殊物種,研究其腸道微生物的結構與功能,并挖掘其中酶學性質優(yōu)良的7α-/7β-HSDH,具有重要的科學意義和工業(yè)價值。然而,自然界中大多數(shù)微生物是不可培養(yǎng)的,動物腸道復雜的厭氧環(huán)境,更加限制了對其中微生物資源的開發(fā)。對環(huán)境樣品進行宏基因組測序使得我們能夠更快更好地了解其微生物組結構與功能,挖掘其中的功能基因。因此,本文基于宏基因組學的研究策略,采集來自四川、云南和黑龍江三個地區(qū)黑熊糞便樣品,比較不同地區(qū)黑熊腸道微生物菌群的結構特征,揭示黑熊腸道微生物的共有微生物組成,解析黑熊腸道微生物組的基... 

【文章來源】：重慶大學重慶市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：128 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
1 緒論
    1.1 課題的研究背景
    1.2 基于宏基因組學發(fā)現(xiàn)生物催化劑的研究現(xiàn)狀
        1.2.1 土壤來源的宏基因組學生物催化劑發(fā)現(xiàn)
        1.2.2 海洋來源的宏基因組學生物催化劑發(fā)現(xiàn)
        1.2.3 腸道微生物來源的宏基因組學生物催化劑發(fā)現(xiàn)
    1.3 科學問題的提出及研究意義
    1.4 課題的研究內容與技術路線
        1.4.1 中國三地黑熊腸道微生物區(qū)系研究
        1.4.2 黑熊腸道宏基因組功能與代謝網(wǎng)絡分析
        1.4.3 黑熊腸道微生物組來源的 7α-/7β-HSDHs的基因挖掘與克隆表征
        1.4.4 黑熊腸道微生物組來源的 7α-/7β-HSDHs的酶學性質研究
        1.4.5 研究的技術路線
    1.5 研究的創(chuàng)新點
2 黑熊腸道微生物菌群的區(qū)系研究
    2.1 引言
    2.2 材料與儀器
        2.2.1 實驗材料
        2.2.2 實驗儀器
    2.3 實驗方法
        2.3.1 糞便采樣
        2.3.2 總DNA提取及PCR擴增
        2.3.3 PCR產物的鑒定、純化及定量
        2.3.4 數(shù)據(jù)優(yōu)化
        2.3.5 OTU聚類
        2.3.6 分類學分析
        2.3.7 Alpha多樣性分析
        2.3.8 Beta多樣性分析
    2.4 結果與討論
        2.4.1 PCR擴增結果
        2.4.2 Alpha多樣性分析及比較
        2.4.3 微生物區(qū)系組成及比較
        2.4.4 共有OTU分析
        2.4.5 菌群結構特征
        2.4.6 菌群LEfSe分析
    2.5 本章小結
3 黑熊腸道微生物組的宏基因組測序及解析
    3.1 引言
    3.2 材料與儀器
        3.2.1 實驗材料
        3.2.2 實驗儀器
    3.3 實驗方法
        3.3.1 總DNA提取及片段化
        3.3.2 Hiseq文庫的構建及測序
        3.3.3 測序數(shù)據(jù)的質控與拼接
        3.3.4 基因預測
        3.3.5 COG功能注釋
        3.3.6 KEGG功能注釋
        3.3.7 物種分類分析
        3.3.8 iPath代謝網(wǎng)絡構建
    3.4 結果與討論
        3.4.1 宏基因組質控
        3.4.2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計及優(yōu)化
        3.4.3 ORF預測及分布
        3.4.4 COG注釋及分布
        3.4.5 基于基因的物種分類
        3.4.6 iPath代謝網(wǎng)絡
    3.5 本章小結
4 基于宏基因組數(shù)據(jù)的 7α-/7β-HSDH挖掘
    4.1 引言
    4.2 材料與儀器
        4.2.1 實驗材料
        4.2.2 實驗儀器
    4.3 實驗方法
        4.3.1 7α-/7β-HSDH基因挖掘
        4.3.2 基因的克隆
        4.3.3 表達載體構建
        4.3.4 基因的表達純化及濃度檢測
        4.3.5 酶活測定
        4.3.6 高效液相色譜檢測
        4.3.7 蛋白等電點及二級結構預測
        4.3.8 蛋白同源比對
    4.4 結果與討論
        4.4.1 目的基因發(fā)掘
        4.4.2 基因序列及電泳檢測
        4.4.3 重組載體雙酶切鑒定
        4.4.4 重組蛋白原核表達及純化
        4.4.5 酶活檢測結果
        4.4.6 產物檢測結果
        4.4.7 蛋白的等電點與二級結構
        4.4.8 同源性及進化樹分析
    4.5 本章小結
5 7α-/7β-HSDHs的酶學性質研究
    5.1 引言
    5.2 材料與儀器
        5.2.1 實驗材料
        5.2.2 實驗儀器
    5.3 實驗方法
        5.3.1 酶的表達與純化
        5.3.2 動力學參數(shù)測定
        5.3.3 溫度對酶活的影響
        5.3.4 pH對酶活的影響
        5.3.5 圓二色譜法測定Tm值
        5.3.6 基因必要性預測
        5.3.7 熱穩(wěn)定性研究
    5.4 結果與討論
        5.4.1 酶的動力學特征
        5.4.2 Tm值與基因必要性分析
        5.4.3 pH對酶的影響
        5.4.4 溫度對酶的影響
        5.4.5 酶的熱穩(wěn)定性比較
    5.5 本章小結
6 全文總結及后續(xù)工作建議
    6.1 全文主要結論
        6.1.1 腸道微生物區(qū)系分布研究
        6.1.2 腸道微生物組功能結構及代謝網(wǎng)絡研究
        6.1.3 7α-/7β-HSDH編碼基因的克隆與驗證
        6.1.4 7α-/7β-HSDH的酶學特性研究
    6.2 后續(xù)工作建議
7 文獻綜述
    7.1 介紹
    7.2 腸道微生物的形成與發(fā)展
    7.3 哺乳動物腸道微生物區(qū)系研究
    7.4 腸道微生物組與人類健康
    7.5 腸道微生物的全基因組測序
    7.6 結論與展望
致謝
參考文獻
附錄
    A. 攻讀博士學位期間的研究成果
    B. 攻讀博士學位期間參研的科研項目



本文編號：2897901