目的:研究積雪草酸(AA)對人肝癌SMMC-7721細胞體外增殖及凋亡的影響;利用小動物活體成像技術(shù)觀察AA對人肝癌裸鼠移植腫瘤生長的影響,從而研究AA體內(nèi)抗肝癌效應及其凋亡的機制方法:不同濃度的AA作用于人肝癌SMMC-7721細胞24 h后顯微鏡觀察其細胞形態(tài)變化,CCK-8法檢測各組細胞活力值,AnnexinV-APC/7-AAD雙染色法流式細胞術(shù)檢測肝癌細胞凋亡率變化,JC-1試劑盒檢測肝癌細胞線粒體膜電位改變,蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測凋亡相關(guān)蛋白P53,Bax,Bcl-2,Cyt-C,Caspase-3和Cleaved Caspase-3在肝癌細胞中的表達。熒光素酶逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染人肝癌SMMC-7721細胞,嘌呤霉素梯度篩選得到穩(wěn)定感染的克隆肝癌細胞(簡稱SMMC-7721-Luc)。選用4~5周齡雄性BALB/c裸鼠15只,建立人肝癌SMMC-7721-Luc細胞裸鼠皮下移植瘤模型后,隨機分為模型組、AA 50mg/Kg組和AA 100mg/Kg組,每組5只。各組裸鼠連續(xù)灌胃給藥21 d,分別于給藥第7 d,14 d,21 d進行活體成像觀察,并在末次活體成像觀察后處死裸鼠后取瘤塊稱重并測量其體積大小,HE病理染色觀察瘤塊內(nèi)細胞形態(tài)以及數(shù)量的變化;TUNEL染色法檢測瘤塊細胞凋亡情況;免疫組織化學法測定瘤塊P53,Bax,Bcl-2,Cyt-C,Caspase-3的陽性表達的平均積分光密度值(IOD);Western Blot法測定凋亡相關(guān)蛋白P53,Bax,Bcl-2,Cyt-C,Caspase-3和Cleaved Caspase-3在腫瘤組織中的表達。結(jié)果:CCK-8結(jié)果顯示:與溶劑對照組相比,隨著AA濃度的增加,抑制率增大,細胞數(shù)量變少,形態(tài)變圓,呈濃度依賴性(P0.01),IC_(50)=38.31μM;AnnexinV-APC/7-AAD雙染色法流式結(jié)果顯示:與溶劑對照組相比,隨著濃度的增加,AA顯著提高對人肝癌SMMC-7721細胞的凋亡率(P0.01);此外,JC-1結(jié)果顯示:與溶劑對照組比較,AA濃度依賴性降低線粒體膜電位(P0.01),在熒光顯微鏡下可以看到紅色/綠色熒光的比值隨濃度的增大而明顯降低;Western blot結(jié)果顯示:40μM AA明顯上調(diào)Bax,Cyt-C和Cleaved Caspase-3蛋白的表達(P0.05或P0.01),下調(diào)Bcl-2,Caspase-3的表達(P0.01),但不影響P53的表達(P0.05)。在體內(nèi)實驗中,成功構(gòu)建了人肝癌SMMC-7721-Luc裸鼠皮下移植瘤模型。活體成像動態(tài)觀察顯示,與模型組相比較,50mg/Kg組和100mg/Kg組的AA能明顯抑制腫瘤的增長(P0.01);瘤塊稱重和體積測量結(jié)果顯示:與模型組比較,100mg/Kg的AA能明顯減少瘤塊的質(zhì)量和體積(P0.01)。HE病理染色結(jié)果顯示,與模型組相比,AA 50mg/Kg和AA 100mg/Kg劑量組均能不同程度地促進肝腫瘤組織細胞凋亡:細胞呈現(xiàn)凋亡形態(tài),細胞數(shù)減少;TUNEL染色結(jié)果顯示:與模型組比較,50mg/Kg AA組和100mg/Kg AA組均能使肝腫瘤細胞凋亡率逐漸增高(P0.01);免疫組織化學方法結(jié)果顯示:與模型組比較,Bax,Cyt-C,Caspase-3在AA 50mg/Kg劑量組和AA 100mg/Kg劑量組中平均積分光密度值陽性表達區(qū)域均明顯升高,Bcl-2陽性表達區(qū)域降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01),P53表達無明顯變化,無差異統(tǒng)計學意義(P0.05);Western Blot結(jié)果顯示,與模型組相比,Bax,Cyt-C,Cleaved Caspase-3蛋白表達在50mg/Kg和100mg/Kg AA組中均明顯升高,Bcl-2和Caspase-3蛋白表達降低(P0.05或P0.01),P53蛋白表達無明顯變化,統(tǒng)計學無差異(P0.05)。結(jié)論:AA可抑制人肝癌SMMC-7721細胞體外增殖及裸鼠移植瘤體內(nèi)生長,其機制可能與AA誘導非P53依賴的線粒體途徑的凋亡有關(guān)。
【學位單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

圖 1：積雪草酸化學結(jié)構(gòu)式Figure 1 The chemical structure ofAsiaticAcid現(xiàn)，AA 在癌癥腫瘤的防治領域具有良聯(lián)合使用能保護肝臟，降低毒副作用[11]素瘤[12]；通過激活人乳腺癌細胞外信號激酶的通路，誘導細胞凋亡和細胞周期[13]；AA 還通過抑制腫瘤細胞增殖的作與人肝癌細胞凋亡的調(diào)控過程[14]。用于在對抗癌癥方面和開發(fā)各種腫瘤的得了一定的初步進展，但是 AA 用于國人口基數(shù)大，是世界上肝癌的患病大 據(jù)研究報道可以用于保護肝臟，保護腦

1 不同濃度 AA 作用 24 h 對人肝癌 SMMC-7721 細胞形態(tài)的影響（orphological changes of human hepatoma SMMC-7721 cells affected24 h (×200)圖 1-1-2 AA 對人肝癌 SMMC-7721 細胞增殖的影響（n=3） Effect ofAAon the proliferation of human hepatoma SMMC-7721 ceV-APC/7-AAD 雙染色法流式細胞術(shù)檢測 A細胞的凋亡影響

19圖 1-1-2 AA 對人肝癌 SMMC-7721 細胞增殖的影響（n=3）ect ofAAon the proliferation of human hepatoma SMMC-77APC/7-AAD 雙染色法流式細胞術(shù)檢測胞的凋亡影響APC/7-AAD 雙染色法流式細胞術(shù)凋亡檢測（3.06±0.08）%，與溶劑對照組比較，隨著 A癌 SMMC-7721 細胞產(chǎn)生明顯的凋亡，并且
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本文編號：2890999