尋找高效、低毒新型免疫抑制劑用于自身免疫性疾病的治療是當前醫(yī)藥研究的熱點之一。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿通過抑制拓撲異構酶Ι(topoisomeraseΙ,TopoΙ)的活性,特異性地促進樹突狀細胞和巨噬細胞RAW264.7分泌IL-10,顯示出潛在免疫抑制活性,可應用于自身免疫性疾病的治療。但進一步研究發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿存在水溶性差,口服生物利用度低等缺陷,限制其進一步開發(fā)。本課題在此基礎上以氯化兩面針堿作為先導化合物進行結構修飾,并通過對衍生物進一步活性評價,旨在獲得成藥性更優(yōu)的TopoΙ抑制劑類免疫抑制小分子。首先,在查閱文獻的基礎上,以5-硝基-2,3-萘二酚為起始原料,經(jīng)七步反應,以40%的總收率完成了兩面針堿的全合成。以全合成路線為基礎,為獲得水溶性改善的兩面針堿衍生物,進行如下結構修飾設計:(1)在兩面針堿母核C-12位引入羥甲基,經(jīng)14步反應,以16%的收率合成了衍生物3-4;(2)依據(jù)已有構效關系,通過兩面針堿母核結構簡化獲得了三類衍生物,分別為3-22(以苯環(huán)替代萘環(huán))、3-28(簡化亞甲二氧基)和3-34(簡化胡椒環(huán));(3)以衍生物3-34為母核結構,在N原子的對位引入不同含氧基團,合成衍生物3-42、3-48、3-52、3-58和3-59。合成實驗部分共完成了8條兩面針堿及其衍生物的合成路線,獲得了40多個中間體及目標化合物,所有中間體及目標化合物均通過高分辨質譜,1HNMR和13C-NMR確證結構。其次,對合成得到的衍生物及中間體進行了促進IL-10分泌活性、構效關系探討、細胞毒測試及TopoΙ抑制活性研究。一、在2μM濃度下,分別在骨髓來源樹突狀細胞(Bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs)和巨噬細胞RAW 264.7上進行了目標化合物的促IL-10分泌活性評價。結果表明,在BMDCs上,所有目標化合物及中間體促IL-10分泌活性均弱于對照化合物兩面針堿;在巨噬細胞RAW 264.7上,部分化合物促IL-10分泌活性顯著優(yōu)于BMDCs上的活性,其中化合物3-15的活性和氯化兩面針堿相當,化合物3-14,3-16和3-4促IL-10升高活性相當于兩面針堿的80%和73%。根據(jù)在巨噬細胞RAW 264.7上的活性篩選結果,構效關系總結如下:(1)兩面針堿母核結構中C-8和C-9位的甲氧基結構是藥效必須基團;(2)不同種類陰離子對活性有影響,碘離子替代氯離子使活性減弱;(3)異喹啉環(huán)結構為非必須結構,部分開環(huán)產(chǎn)物也顯示活性;(4)母核結構中N原子對位為醛基取代活性優(yōu)于羥基取代。選取部分促IL-10升高活性較好的衍生物,分別在巨噬細胞RAW 264.7和正常肝細胞L-02上進行了細胞毒性測試,結果顯示部分衍生物細胞毒性弱于對照化合物氯化兩面針堿。二、在不同濃度下(2–20μM),評價了目標化合物的TopoΙ抑制活性,結果顯示,在20μM濃度下,衍生物2-13、3-4、3-16、3-22、3-28、3-34、3-48、3-51和3-58具有TopoΙ抑制活性;特別是在2μM濃度條件下,化合物2-13、3-4、3-16和3-22仍然顯示與兩面針堿和喜樹堿相當?shù)腡opoΙ抑制活性。這一活性測試結果表明化合物2-13、3-4、3-16和3-22在TopoΙ抑制活性和促進IL-10分泌活性之間具有一定的一致性,進一步的對接研究也解釋了這些化合物與TopoΙ的作用方式。基于以上活性研究結果,選取化合物3-22和3-48在膿毒癥小鼠模型上進行體內活性研究。實驗結果顯示,衍生物3-22和3-48在10 mg/kg時不能改善膿毒癥小鼠的生存率;但在較低濃度3 mg/kg時,衍生物3-48能明顯改善膿毒癥小鼠的生存率,84 h時小鼠的生存率和氯化兩面針堿在3 mg/kg時的生存率相當。結合細胞毒性篩選結果和其他活性數(shù)據(jù),衍生物3-48可作為優(yōu)選化合物進行進一步的研究。綜上所述,本論文通過對TopoΙ抑制劑氯化兩面針堿結構改造及其促IL-10分泌活性研究,獲得了新的具有促IL-10升高活性保持,同時毒性降低,水溶性得到改善的先導化合物。本論文研究希望能為發(fā)現(xiàn)活性更好、成藥性更優(yōu)的TopoΙ抑制劑類免疫抑制小分子提供新的方向。
【學位單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R284;R285
【部分圖文】：

圖 1-2 生物堿在 BMDCs 上活性篩選結果Fig.1-2 The screening results of alkaloids on BMDCs圖 1-3 生物堿在巨噬細胞 RAW 264.7 上活性篩選結果Fig.1-3 The screening results of alkaloids on RAW 264.7 cells綜合以上結果，氯化兩面針堿是截止目前本課題組從天然產(chǎn)物庫中篩選獲得的活性最優(yōu)的備選化合物，它能特異性的促進 IL-10 分泌，表現(xiàn)出潛在的免疫抑

圖 1-3 生物堿在巨噬細胞 RAW 264.7 上活性篩選結果Fig.1-3 The screening results of alkaloids on RAW 264.7 cells綜合以上結果，氯化兩面針堿是截止目前本課題組從天然產(chǎn)物庫中篩選獲得的活性最優(yōu)的備選化合物，它能特異性的促進 IL-10 分泌，表現(xiàn)出潛在的免疫抑制功能，能夠用于新型免疫抑制劑的研究開發(fā)。有關氯化兩面針堿促進IL-10分泌的機制，本課題組前期也進行了深入研究。做為一個經(jīng)典的拓撲異構酶 Ι(Topo Ι)抑制劑，其主要作用機制是：通過抑制 TopoΙ 的活性，引起 DNA 損傷，從而激活 DNA 損傷應答和下游通路，進而上調 IL-10 的表達來發(fā)揮免疫抑制作用(該部分研究工作尚未發(fā)表)。四、拓撲異構酶 I 抑制劑與自身免疫性疾病的關系拓撲異構酶 Ι(TopoΙ)是生物體內廣泛存在的一類必須酶，通過切割 DNA 一條鏈中的磷酸二酯鍵，進而調節(jié) DNA 的拓撲狀態(tài)，從而參與 DNA 復制、轉錄、重組和修復等所有關鍵核內過程。Topo Ι 抑制劑通過抑制 Topo Ι 的活性，干擾

胞 RAW 264.7 上，除中間體 3-41 不能有效的促進 IL-10 分泌外，其余化合物均能不同程度的上調 IL-10 的表達；化合物 3-46 3-48 為引入羧酸乙酯的簡化結構衍生物及其中間體，在巨噬細胞 RAW 264.7 上，除中間體 3-47 不能有效的促進IL-10 的分泌外，其他化合物均能不同程度的上調 IL-10 的表達，目標衍生物 3-48 的活性最好；化合物 3-49 3-52 為引入羥甲基的簡化結構衍生物及其中間體，在 RAW 264.7 細胞上，均能不同程度的促進 IL-10 的分泌，中間體 3-51 的活性最好；衍生物 3-56 3-59 為引入異丙氧基和酚羥基的簡化結構衍生物及其中間體，除目標化合物 3-58 和 3-59 不能上調 IL-10 的表達外，其余中間體均能不同程度的上調 IL-10 的表達。在上述活性篩選的基礎上，選取部分衍生物在 5μM 和 10μM 較高濃度下進行復篩，活性篩選結果見圖 4-2。在 5 μM 和 10 μM 濃度下，氯化兩面針堿(1-9)和衍生物促進 IL-10 分泌的活性均較在 2 μM 時降低，說明在較低的濃度下，其免疫抑制活性較好。同時實驗中發(fā)現(xiàn)，氯化兩面針堿(1-9)5μM 組貼壁細胞較少，漂浮細胞少，呈現(xiàn)增殖抑制現(xiàn)象。原因可能是化合物在較高濃度下，有較強的抑制增殖的作用，導致促進 IL-10 分泌活性有所降低。
【參考文獻】

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本文編號：2890450