目的病毒性爆發(fā)性肝炎(Viral fulminant hepatitis,簡稱FH)是一種嚴(yán)重的肝臟疾病,由于肝臟組織炎癥反應(yīng)過度,死亡率較高。對FH疾病中的炎癥信號通路缺乏認(rèn)識嚴(yán)重阻礙了臨床疾病干預(yù)措施的實(shí)施。髓系分化原反應(yīng)基因88(MyD88)是大多數(shù)TLR、IL-1R和IL-18R依賴性炎癥信號通路的關(guān)鍵受體蛋白,在介導(dǎo)宿主對病原菌入侵的原反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。這種信號通路的過度激活會加劇某些疾病,而這些疾病在本質(zhì)上是致命的。但MyD88信號通路是否及如何參與病毒性爆發(fā)性肝炎(viral fulminant hepatitis,FH)的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。本研究旨在通過揭示MyD88介導(dǎo)的信號通路與病毒性爆發(fā)性肝炎的關(guān)系,為FH疾病的治療策略提供新的線索和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法構(gòu)建小鼠病毒性爆發(fā)性肝炎模型,監(jiān)測C57BL/6、Rag-1~(-/-)、Trif~(-/-)、Myd88~(-/-)小鼠20天內(nèi)的存活情況;感染MHV3病毒0h、48h和72h后,收集MyD88~(-/-)和WT小鼠的肝臟組織,用HE染色檢測兩組小鼠肝臟損傷差異;用Tunel技術(shù)檢測小鼠肝細(xì)胞凋亡情況;采用Western-Blot檢測感染48h和72h后小鼠肝臟內(nèi)MHV-3受體Bgp-1的表達(dá)情況;采用斑塊法分析感染72h后肝臟病毒滴度。感染MHV3病毒0h、24h、48h和72h后,收集MyD88~(-/-)和WT小鼠的肝臟組織,用RT-qPCR、Western-Blot、ELISA檢測FGL2的mRNA和蛋白表達(dá)水平;免疫組化檢測FGL2和Fibrinogen的表達(dá)情況。監(jiān)測FGL2~(-/-)和C57BL/6小鼠感染MHV3病毒20天內(nèi)的生存差異。用RT-qPCR、Western-Blot、免疫組化檢測小鼠IFN-γ、TNF-α、IL-6和proIL-1β的mRNA和蛋白表達(dá)水平;監(jiān)測TNF-α~(-/-)、IL-1R~(-/-)和C57BL/6小鼠感染MHV3病毒20天內(nèi)的生存差異。相同周齡的C57BL/6(WT)和MyD88~(-/-)小鼠感染MHV-3(100 PFU)后,從感染的肝臟中分離細(xì)胞,用流式細(xì)胞術(shù)檢測肝臟中Lin~-Thy1.2~+ILCs浸潤情況;用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析肝臟中Lin~-Thy1.2~+ILCs和NKp46~-Lin~-Thy1.2~+Roγt~+ILC3浸潤情況;NKp46~-Lin~-Thy1.2~+Roγt~+ILC3細(xì)胞分泌的IL-17、TNF-α和IL-1β用流式進(jìn)行檢測。巨噬細(xì)胞系Raw264.7細(xì)胞經(jīng)MHV-3感染(MOI=1),免疫熒光共聚焦顯微鏡監(jiān)測未感染或感染24h后HMGB1定位;ELISA檢測細(xì)胞上清液中HMGB1的濃度。相同周齡的C57BL/6(WT)和MyD88~(-/-)小鼠感染MHV-3(100 PFU)后,分別在不同時(shí)間點(diǎn)提取肝組織,用免疫組化和免疫熒光檢測HMGB1蛋白在正常和感染MHV-3的肝組織中表達(dá)情況;用ELISA檢測MyD88~(-/-)和WT小鼠血清中HMGB1的濃度,N=5/組;用Western-Blot檢測MyD88~(-/-)和WT小鼠肝臟中HMGB1蛋白水平,N=4/組。結(jié)果與WT小鼠相比,MyD88~(-/-)小鼠的生存周期明顯延長(P0.001)。HE和Tunel結(jié)果顯示MyD88~(-/-)小鼠的肝組織損傷和肝細(xì)胞凋亡情況明顯減輕。Western-Blot顯示MyD88~(-/-)小鼠的MHV3受體Bgp-1蛋白表達(dá)明顯降低。斑塊法分析感染MHV3病毒72h后MyD88~(-/-)小鼠肝臟病毒滴度顯著下降(P0.05)。RT-qPCR、Western-Blot、ELISA檢測顯示MyD88~(-/-)小鼠肝臟中fgl2的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低,尤其是在72h差異最為明顯(P0.05)。免疫組化顯示相比WT小鼠,MyD88~(-/-)小鼠的fgl2和fibrinogen表達(dá)顯著下降。相比C57BL/6小鼠,fgl2~(-/-)小鼠的生存周期明顯延長(P0.001)。RT-qPCR、Western-Blot和免疫組化檢測結(jié)果顯示MyD88~(-/-)小鼠肝臟中IFN-γ、TNF-α、IL-6和proIL-1β的表達(dá)顯著下降(P0.05)。相比C57BL/6小鼠,TNF-α~(-/-)和IL-1R1~(-/-)小鼠的生存期顯著延長(P0.05)。流式細(xì)胞儀檢測顯示,在感染MHV3病毒24h和48h后,WT肝臟中浸潤的ILCs(Lin~-Thy1.2~+)明顯高于MyD88~(-/-)小鼠(P0.05)。此外,統(tǒng)計(jì)分析表明,MyD88~(-/-)小鼠感染MHV-3后,肝臟組織中的NKp46~-Lin~-Thy1.2~+Roγt~+第三組固有淋巴細(xì)胞(ILC3)顯著減少。而這些ILC3有能力產(chǎn)生促炎介質(zhì),如proIL-1β,TNF-α和IL-17等。巨噬細(xì)胞系Raw264.7細(xì)胞未感染時(shí),免疫熒光共聚焦顯微鏡顯示HMGB1分布在細(xì)胞核內(nèi)。而當(dāng)細(xì)胞感染MHV-3(MOI=1)后,HMGB1定位于細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。而且,感染72h后,上清液中積累的HMGB1濃度也隨時(shí)間逐漸增加。在感染MHV3病毒的小鼠肝臟內(nèi),發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象,HMGB1從細(xì)胞核遷移到胞質(zhì)內(nèi),并且相比WT小鼠,MyD88~(-/-)小鼠血清和肝臟中的HMGB1顯著下調(diào)(P0.05)。結(jié)論成功構(gòu)建了病毒性爆發(fā)性肝炎模型,闡明了MyD88~(-/-)小鼠可以通過減少肝臟中HMGB1的分泌,進(jìn)而減弱促炎反應(yīng);可以通過減少肝臟中NKp46~-Lin~-Thy1.2~+Roγt~+第三組固有淋巴細(xì)胞(ILC3)的浸潤,減少多種促炎細(xì)胞因子的分泌,進(jìn)而減輕肝臟組織的病變和損傷情況,延長感染爆發(fā)性肝炎小鼠的生存周期。綜上結(jié)果所述,MyD88基因會加重實(shí)驗(yàn)性病毒性重型肝炎的免疫病理。我們可以通過適當(dāng)調(diào)節(jié)MyD88信號通路,并結(jié)合阻斷其他炎癥因子,來達(dá)到治療人類病毒性FH等嚴(yán)重炎癥疾病的目的。
【學(xué)位單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

結(jié)果結(jié)果MyD88-/-小鼠感染后肝組織損傷和死亡率變化情況小鼠病毒性爆發(fā)性肝炎（FH）模型的構(gòu)建從液氮罐中取出凍存的 MHV-3 病毒(1×107PFU/mL)，放于冰上融化。用無理鹽水稀釋病毒滴度至 1PFU/ul。之后往 12 周齡的 C57BL/6 野生型小鼠的注射 100ul 的 MHV-3 病毒(100PFU/只)，感染 0h，48h，72h 后收集小鼠的織，檢測小鼠的肝組織損傷情況等指標(biāo)。如圖 1 所示，小鼠肝組織損傷嚴(yán)感染 72h 后病毒滴度很高，實(shí)驗(yàn)性病毒性爆發(fā)性肝炎（FH）小鼠模型建模

測小鼠 20 天內(nèi)的存活率。相同周齡的 C57BL/6 (WT)和 MyD88-/-小鼠感染 MHV-3 (1對存活率進(jìn)行了總共 20 天的監(jiān)測。重復(fù)了三次，結(jié)果都相似，P < 0.05 即認(rèn)為具有異。 Monitoring survival rate of mice within 20 days. Age matched C57BL/6 (WT) nic MyD88-/-mice were infected with MHV-3(100 PFU) , (A) the survival rate wored for a total of 20 days. One representative of three experiments with sim is shown. *P < 0.05.了評估先天免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)在重癥病毒性肝炎中的作用,相同周齡的L/6 (WT, n = 10), Rag-1-/-(n = 6), MyD88-/-(n = 11) 和 Trif-/-(n = 5) 小鼠腹腔注U 的 MHV-3 病毒，隨后監(jiān)測這些小鼠的死亡率。令人驚訝的是，我們發(fā)現(xiàn)Rag1-/-和 Trif-/-小鼠在感染后 8 天內(nèi)全部死亡，而 MyD88-/-組中超過 72.7% 的小鼠在感染 20 天后仍然存活(圖 2)。結(jié)果顯示，這些結(jié)果表明，MyD88 Trif 基因缺失更能顯著降低 MHV-3 誘導(dǎo)的發(fā)病率和死亡率，而且適應(yīng)性1 缺乏)在發(fā)病機(jī)制中并不起主要作用。組織損傷以及肝細(xì)胞凋亡情況檢測

圖 3 肝組織損傷以及肝細(xì)胞凋亡情況。相同周齡的 C57BL/6 (WT) 和 MyD88-/-小鼠感染MHV-3 (100 PFU)，在不同時(shí)間點(diǎn)，從感染病毒的 WT 和 MyD88-/-小鼠中分離肝組織，(A)用H&E 染色進(jìn)行肝組織形態(tài)學(xué)分析，(B)用 TUNEL 染色分析細(xì)胞的凋亡情況。比例尺= 20μm。Fig 3. Age matched C57BL/6 (WT) and congenic MyD88-/-mice were infected withMHV-3 (100 PFU), liver tissues were isolated from virus infected WT and congenicMyD88-/-mice at different time points, (A) the morphology was analyzed by H&Estaining, (B) cells undergoing apoptosis was analyzed by TUNEL staining. Scale bar=20μm.相同周齡的 C57BL/6 (WT) 和 MyD88-/-小鼠感染 MHV-3 (100 PFU)，在感染后的 0h、48h 和 72h，取小鼠的肝臟組織，進(jìn)行 HE 檢測。HE 染色顯示(圖 3A)，感染 MHV-3 病毒 48h 和 72h 后，WT 小鼠肝臟出現(xiàn)嚴(yán)重壞死并伴有稀疏的多形核白細(xì)胞浸潤。而 MyD88-/-肝臟形態(tài)在 48h 基本正常，壞死面積在 72h 也明顯減少。小鼠注射 MHV-3 病毒 0h、48h 和 72 后，取小鼠的肝臟組織，用 TUNEL 試劑盒檢測肝細(xì)胞的凋亡情況(圖 3B)。和 HE 結(jié)果相吻合，WT 小鼠的肝細(xì)胞凋亡數(shù)量要明顯多于 MyD88-/-小鼠。尤其是在感染 MHV-3 病毒 72h 后，兩組之間的差異更
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本文編號：2885849