【摘要】：目的:觀察芪參湯對肝竇內(nèi)皮細(xì)胞去分化及自噬的影響。方法:大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSEC)隨機(jī)分為空白組、模型組、芪參湯低、中、高和抑制劑組,通過100μg/mL的氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)誘導(dǎo)24 h建模并給予相應(yīng)的藥物或血清進(jìn)行干預(yù)。分別采用RT-qPCR及免疫熒光染色法檢測VEGFR2及ET1的表達(dá)水平,透射電鏡檢測LSEC超微結(jié)構(gòu),ELISA法檢測NO含量,Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白(LC3BI、LC3BII和p62)及內(nèi)皮細(xì)胞功能相關(guān)蛋白(eNOS及其磷酸化水平)的表達(dá)水平。結(jié)果:透射電鏡結(jié)果顯示,芪參湯含藥血清能增加LSEC細(xì)胞中窗孔、自噬體的數(shù)量,抑制內(nèi)皮下基底膜形成。與模型組相比,芪參湯含藥血清能夠明顯上調(diào)LSEC中VEGFR2 mRNA及蛋白的表達(dá)水平,下調(diào)ET1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。此外,芪參湯還能明顯增加LSEC中LC3BⅡ、p-eNOS、eNOS蛋白的表達(dá)和LC3BⅡ/LC3BI、p-eNOS/eNOS比值,降低LC3BI和p62蛋白的表達(dá),與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:芪參湯能夠通過促進(jìn)LSEC自噬水平抑制其去分化水平,進(jìn)而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。
【圖文】：

透射電鏡結(jié)果顯示,空白組LSEC細(xì)胞中可見大量窗孔,內(nèi)皮下未見基底膜形成,同時可見少量自噬體。oxLDL能夠明顯減少LSEC細(xì)胞中窗孔及自噬體的數(shù)量,同時局部內(nèi)皮下可見連續(xù)基底膜。芪參湯各劑量組均能增加LSEC細(xì)胞中窗孔、自噬體的數(shù)量,抑制內(nèi)皮下基底膜形成,并且呈現(xiàn)濃度依賴的方式。與模型組相比,抑制劑組中LSEC細(xì)胞中窗孔及自噬體的數(shù)量明顯增加,同時局部內(nèi)皮下可見連續(xù)基底膜。見圖1。2.2 芪參湯對LSEC中VEGFR2及ET1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

100 μg/mL oxLDL能夠明顯降低LSEC中VEGFR2 mRNA及蛋白的表達(dá)水平,上調(diào)ET1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平,進(jìn)而促進(jìn)LSEC從分化型向去分化型的轉(zhuǎn)化,與空白組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。芪參湯各濃度含藥血清均能顯著上調(diào)LSEC中VEGFR2 mRNA及蛋白的表達(dá)水平,下調(diào)ET1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平,進(jìn)而逆轉(zhuǎn)LSEC的去分化,與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。作為自噬抑制劑的氯喹與oxLDL作用相同,能夠顯著降低LSEC中VEGFR2 mRNA及蛋白的表達(dá)水平,上調(diào)ET1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平,加重LSEC從分化型向去分化型的轉(zhuǎn)化,與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、2和圖2。表1 各組LSEC中VEGFR2及ET1 mRNA表達(dá)的比較 (n=3, x ˉ ±s) Tab 1 Comparison of VEGFR2 and ET1 mRNA expression in LSEC of each group (n=3, x ˉ ±s) 組別 藥物濃度 VEGFR2 mRNA ET1 mRNA 空白組 不含藥血清 1.00±0.01 1.00±0.02 模型組 不含藥血清 0.34±0.08* 2.78±0.33* 低劑量組 4.23 g/kg芪參湯 0.45±0.11# 2.19±0.24# 中劑量組 8.46 g/kg芪參湯 0.57±0.09# 1.85±0.16# 高劑量組 16.92 g/kg芪參湯 0.93±0.17# 1.32±0.15# 抑制劑組 不含藥血清+20 μmol氯喹 0.22±0.05# 3.41±0.41# 注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。

與空白組相比,模型組中LC3BⅡ、p-eNOS、eNOS蛋白的表達(dá)和LC3BⅡ/LC3BI、p-eNOS/eNOS比值明顯降低,LC3BI和p62蛋白的表達(dá)顯著增加,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比,芪參湯中、高劑量均能明顯增加LSEC中LC3BⅡ、p-eNOS、eNOS蛋白的表達(dá)和LC3BⅡ/LC3BI、p-eNOS/eNOS比值,降低LC3BI和p62蛋白的表達(dá),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比,氯喹能夠增加LC3BⅡ/LC3BI的比值和p62蛋白的表達(dá),降低p-eNOS、eNOS蛋白的表達(dá)和p-eNOS/eNOS比值,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4、5和圖3。表4 各組LSEC中自噬標(biāo)記蛋白表達(dá)的比較 (n=3, x ˉ ±s) Tab 4 Comparison of autophagy marker protein expression in LSEC of each group (n=3, x ˉ ±s) 組別 LC3BⅡ/β-actin LC3BI/β-actin LC3BⅡ/LC3BI p62/β-actin 空白組 0.22±0.03 0.31±0.04 0.65±0.15 0.23±0.04 模型組 0.12±0.02* 0.42±0.06* 0.25±0.07* 0.53±0.09* 低劑量組 0.15±0.03 0.40±0.05 0.28±0.05 0.42±0.12 中劑量組 0.20±0.04# 0.33±0.04# 0.60±0.11# 0.31±0.07# 高劑量組 0.31±0.06# 0.21±0.03# 1.42±0.21# 0.21±0.05# 抑制劑組 0.19±0.03 0.42±0.05 0.51±0.09# 0.81±0.16# 注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。
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