系統(tǒng)性白念珠菌感染病人日益增多,且病死率高達(dá)30%,天然耐藥和獲得性耐藥為白念珠菌感染的治療帶來了巨大困難。臨床上治療侵襲性白念珠菌感染面臨著藥物種類少、耐藥性強(qiáng)、副作用多的窘境,且抗真菌藥物的研發(fā)進(jìn)展十分緩慢,近十多年來未發(fā)現(xiàn)基于新靶點(diǎn)的抗耐藥真菌新藥。因此,研發(fā)高效、低毒的抗耐藥真菌新藥成為亟需解決的科學(xué)難題。本課題組前期從協(xié)同抗耐藥白念珠菌的策略出發(fā),發(fā)現(xiàn)了黃芩素等多個(gè)具有協(xié)同抗耐藥白念珠菌活性的天然小分子化合物,并通過構(gòu)效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)了它們共有的藥效基團(tuán),但具體作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制尚不明確。本研究擬采用基于iTRAQ的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果研究活性化合物黃芩素作用白念珠菌細(xì)胞后特異性差異蛋白和作用靶點(diǎn);采用基因敲除技術(shù)構(gòu)建靶蛋白基因缺失菌,比較活性化合物作用基因缺失菌和野生菌后的表型差異,關(guān)聯(lián)分析靶蛋白的生物學(xué)功能及深入研究活性化合物抗耐藥白念珠菌的細(xì)胞和分子機(jī)制,為研究新型高效低毒的抗耐藥真菌藥物提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。首先,在提取白念珠菌總蛋白實(shí)驗(yàn)中,我們以蛋白濃度穩(wěn)定、SDS-PAGE電泳蛋白條帶清晰均勻并結(jié)合iTRAQ實(shí)驗(yàn)對(duì)蛋白的要求為標(biāo)準(zhǔn),探索總結(jié)了高質(zhì)量提取白念珠菌總蛋白的實(shí)驗(yàn)體系。在iTRAQ實(shí)驗(yàn)中,我們成功篩選出氟康唑的靶蛋白ERG11,確證了iTRAQ技術(shù)篩選小分子藥物作用靶蛋白的可行性。接著,我們篩選出黃芩素作用白念珠菌的差異蛋白共112種,其中重復(fù)差異蛋白16種。對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO分析和Pathway分析可知:差異蛋白的分子功能主要為:L-蘋果酸脫氫酶活性、ATP結(jié)合、金屬離子結(jié)合等;所在細(xì)胞位置主要為:細(xì)胞質(zhì)、過氧化物酶體等;主要參與的生物過程為:三羧酸循環(huán)、脂肪酸β-氧化等。KEGG Pathway分析顯示有14條可能相關(guān)的通路,主要為生物合成次生代謝物、抗生素碳、丙酮酸代謝等。然后,通過對(duì)16種重復(fù)差異蛋白的逐一分析,篩選出CPD2、SNQ2、CYS3、DBP2、PMA1、SLA2六個(gè)基因嘗試基因敲除進(jìn)一步考察其功能是否與黃芩素抗耐藥白念珠菌作用相關(guān)。接著,我們采用HIS1-LEU2-ARG4基因敲除策略對(duì)上述六個(gè)基因嘗試了基因敲除。其中,成功構(gòu)建CPD2基因缺失菌及回復(fù)菌。表型考察實(shí)驗(yàn)表明,CPD2基因缺失后不影響白念珠菌的生長繁殖、菌絲形成、生物被膜形成和細(xì)胞表面疏水性,僅導(dǎo)致白念珠菌對(duì)H_2O_2、LiCl和卡泊芬凈敏感性增加,對(duì)黃芩素、特比萘芬敏感性降低。小鼠系統(tǒng)性真菌感染生存率實(shí)驗(yàn)和肝、腎載菌量實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,CPD2基因缺失對(duì)白念珠菌的毒力無明顯影響,但CPD2基因缺失后,白念珠菌對(duì)黃芩素的敏感性減低。體外藥敏實(shí)驗(yàn)也表明:CPD2基因缺失后,白念珠菌對(duì)黃芩素的敏感性減低,基于以上結(jié)果,我們推斷黃芩素發(fā)揮抗耐藥白念珠菌的作用可能與CPD2基因功能相關(guān)。為研究黃芩素抗耐藥白念珠菌作用機(jī)制,我們考察了黃芩素對(duì)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白外排功能的影響,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用及與凋亡相關(guān)的一系列指標(biāo)。羅丹明6G外排實(shí)驗(yàn)表明,CPD2基因缺失可能影響藥物外排蛋白Mdr1p的功能或刺激MDR1基因的表達(dá)下調(diào);黃芩素發(fā)揮抗真菌作用與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白無關(guān);而氟康唑可刺激CDR1基因表達(dá)上調(diào)。細(xì)胞凋亡比例分析、Caspase酶活性實(shí)驗(yàn)、ROS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)及線粒體膜電位檢測(cè)等一系列凋亡相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明:黃芩素可能通過損傷線粒體的Caspase通路來誘導(dǎo)白念珠菌細(xì)胞凋亡,而CPD2基因缺失對(duì)黃芩素的這一功能具有抑制作用。綜上所述,本課題基于iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),篩選出小分子化合物黃芩素作用于白念珠菌后的表達(dá)上調(diào)蛋白Cpd2p,然后敲除了CPD2基因,通過表型考察及誘導(dǎo)凋亡相關(guān)機(jī)制研究,發(fā)現(xiàn)CPD2基因功能與黃芩素誘導(dǎo)白念珠菌細(xì)胞凋亡有關(guān)。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285
【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
前言
第一部分 iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)藥物作用后白念珠菌蛋白表達(dá)
    一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>    二.實(shí)驗(yàn)材料
        （一）菌株
        （二）試劑
        （三）儀器
        （四）試劑配制
        （五）藥物
        （六）藥物配制
    三.實(shí)驗(yàn)方法
        （一）菌株活化
        （二）白念珠菌總蛋白提取及鑒定
        （三）ITRAQ檢測(cè)
        （四）RT-QPCR實(shí)驗(yàn)
    四.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        （一）白念珠菌總蛋白提取及鑒定
        （二）iTRAQ實(shí)驗(yàn)差異蛋白分析
        （三）RT-QPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證差異蛋白基因表達(dá)
    五.討論
第二部分 差異蛋白基因缺失菌、回復(fù)菌構(gòu)建及表型考察
    一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>    二.實(shí)驗(yàn)材料
        （一）動(dòng)物
        （二）菌株
        （三）試劑
        （四）儀器
        （五）試劑配制
        （六）藥物
    三.實(shí)驗(yàn)方法
        （一）融合片段構(gòu)建及鑒定
        （二）目的基因敲除及鑒定
        （三）回復(fù)菌構(gòu)建及鑒定
        （四）表型考察
    四.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        （一）菌株構(gòu)建
        （二）CPD2Δ/Δ菌表型考察
    五.討論
第三部分 黃芩素抗耐藥白念珠菌的作用機(jī)制研究
    一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>    二.實(shí)驗(yàn)材料
        （一）菌株
        （二）試劑
        （三）儀器
        （四）試劑配制
        （五）藥物
    三.實(shí)驗(yàn)方法
        （一）羅丹明6G外排實(shí)驗(yàn)
        （二）凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞和活細(xì)胞比例分析
        （三）Caspase酶活性檢測(cè)
        （四）細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS含量檢測(cè)
        （五）線粒體膜電位測(cè)定
    四.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        （一）黃芩素、氟康唑?qū)Ω骶_丹明6G外排的影響
        （二）黃芩素誘導(dǎo)白念珠菌細(xì)胞發(fā)生凋亡
        （三）黃芩素誘導(dǎo)白念珠菌Casepase酶活性升高
        （四）黃芩素誘導(dǎo)白念珠菌細(xì)胞內(nèi)ROS積累
        （五）黃芩素誘導(dǎo)白念珠菌線粒體膜電位降低
    五.討論
總結(jié)
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作說明
致謝

【參考文獻(xiàn)】

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1 辛文妤;宋俊科;何國榮;杜冠華;;黃芩素和黃芩苷的藥理作用及機(jī)制研究進(jìn)展[J];中國新藥雜志;2013年06期

本文編號(hào)：2872420