目的:中醫(yī)臨床遣藥組方常同時應(yīng)用兩味藥物,通過配伍組合后產(chǎn)生協(xié)同增效或配伍減毒的效應(yīng)。這種在臨床上最為習(xí)用的一對中藥稱為藥對,本文探究藥對白花蛇舌草-半枝蓮配伍后的化學(xué)成分變化規(guī)律,考察藥對的最適宜配比,篩選藥對的提取及大孔樹脂純化工藝,并考察該藥對黃酮提取物的體外抗腫瘤活性,建立UPLC譜效關(guān)系,探討藥對中化學(xué)成分與抗腫瘤活性的內(nèi)在科學(xué)聯(lián)系。方法:(1)分別建立UPLC-PDA法測定藥對中總黃酮含量,苯酚-硫酸法測定多糖含量,考察提取溶劑(乙醇、水)、提取方式(合提、單提、單提合并)與藥對配伍比例(2:1、1:1、1:2)在提取過程中對有效部位總黃酮與總多糖影響,探究藥對中化學(xué)成分的配伍規(guī)律。(2)結(jié)合藥對配伍分析結(jié)果與臨床實(shí)際應(yīng)用,應(yīng)用MTT比色法探究藥對水煎液的體外抗腫瘤活性。分別使用不同配伍比例(1:2、1:1、2:1)的藥對水煎液對人胃癌細(xì)胞株(SGC-7901)、人肺癌細(xì)胞株(A549)、人肝癌細(xì)胞(Hep G2)、人宮頸癌細(xì)胞(He La)進(jìn)行抗腫瘤活性試驗(yàn),計(jì)算IC50,篩選出最敏感細(xì)胞株及最優(yōu)配伍比例,并與陽性藥、單味藥(白花蛇舌草、半枝蓮)水煎液進(jìn)行對比研究。(3)建立多批藥對水煎液的指紋圖譜,并應(yīng)用灰色關(guān)聯(lián)度分析法探究藥對水煎液的UPLC譜效關(guān)系,追蹤對抗腫瘤活性貢獻(xiàn)較大的化學(xué)成分和有效部位。(4)使用分離材料大孔樹脂以單因素試驗(yàn)法篩選出藥對(配伍比例1:1)、白花蛇舌草與半枝蓮的黃酮純化工藝。(5)應(yīng)用MTT比色法對比考察藥對白花蛇舌草與半枝蓮有效成分富集前后的藥理活性的變化情況,并進(jìn)一步探究二者黃酮提取物的藥效配伍規(guī)律。結(jié)果:(1)以乙醇為溶劑的提取液中黃酮含量更高,尤其是白花蛇舌草黃酮,溶出量較水提增加約50%,半枝蓮黃酮增加約10%。提取方式(合提、單提、單提合并)與配伍比例(2:1、1:1、1:2)對有效部位(總黃酮、總多糖)的影響很小。其中,當(dāng)配伍比例1:1合并提取時,半枝蓮黃酮溶出量較單提時顯著提高。(2)各腫瘤細(xì)胞株對藥對水煎液的敏感程度順序?yàn)?SGC-7901A549Hep G2He La。其中,藥對水煎液對SGC-7901的抑制、殺傷能力最強(qiáng),尤其是配伍比例1:1,其IC50為2.16mg/m L。對于SGC-7901,白花蛇舌草、半枝蓮與各配比的藥對水煎液的IC50均小于中藥陽性藥,但藥效遠(yuǎn)不及抗癌藥鹽酸阿霉素,二者的IC50相差200余倍。白花蛇舌草與半枝蓮等量合煎后表現(xiàn)出一定的協(xié)同作用。(3)經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)分析可知,10批藥對水煎液UPLC色譜圖中包含21個共有峰,8批相似度不小于0.94,其余2批相似度為0.897、0.683。在共有峰與峰面積較大的非共有峰(峰面積0.5%)中,黃酮類成分?jǐn)?shù)量占比較大,均約50%。經(jīng)譜效關(guān)系研究可知,黃酮類成分的藥效關(guān)聯(lián)度大于非黃酮成分,藥對水煎液對SGC-7901的藥效活性主要由黃酮成分貢獻(xiàn),其中B、C兩類黃酮與抗腫瘤的關(guān)聯(lián)度最高(B類為帶Ⅱ281~284nm、帶Ⅰ333~342nm的黃酮、C類為二氫黃酮(醇)類黃酮)。(4)使用大孔樹脂篩選藥對(配伍比例1:1)、白花蛇舌草與半枝蓮的黃酮純化工藝,工藝如下。藥對黃酮類成分的純化工藝:濃度0.03g/m L的提取液上樣,上樣液體積6BV,上樣流速9BV/h,7BV蒸餾水除去雜質(zhì),水洗流速9BV/h,80%乙醇洗脫,洗脫液體積3BV,洗脫流速1BV/h。白花蛇舌草黃酮類成分的純化工藝:濃度0.15g/m L的提取液上樣,上樣液體積7BV,上樣流速1BV/h,9BV蒸餾水除去雜質(zhì),水洗流速9BV/h,80%乙醇洗脫,洗脫液體積3BV,洗脫流速9BV/h。半枝蓮黃酮類成分的純化工藝:濃度為0.05g/m L的提取液上樣,上樣液體積5BV,上樣流速1BV/h,8BV蒸餾水水洗除去雜質(zhì),水洗流速9BV/h,60%乙醇洗脫,洗脫體積3BV,洗脫流速9BV/h。在上述工藝方法下,藥對、白花蛇舌草和半枝蓮提取物的黃酮純度分別達(dá)到46.16±2.46%、39.82±1.58%和51.42±4.44%。(5)藥對(配伍比例1:1)、白花蛇舌草和半枝蓮的提取物的IC50分別為115、111和147μg/m L,鹽酸阿霉素IC50為20.5μg/m L。藥材經(jīng)富集純化后表現(xiàn)出了優(yōu)越的抗腫瘤活性(它們的IC50僅為各自水煎液的1/20左右),使其藥理活性與鹽酸阿霉素處于同一數(shù)量級。故認(rèn)為黃酮類成分是藥對抑制、殺傷SGC-7901的重要有效部位。另外,白花蛇舌草與半枝蓮提取物配伍后可表現(xiàn)出一定的協(xié)同作用。結(jié)論:乙醇作為提取溶劑可溶出更多的黃酮成分,提取方式與配伍比例對總黃酮與總多糖的含量影響很小;藥對配比1:1乙醇合并提取得到的黃酮含量最高。臨床上均應(yīng)用該藥對的水煎液,因此我們研究了藥對水煎液對SGC-7901、A549、Hep G2與He La的活性,結(jié)果表明藥對水煎液可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、生長,其中,水煎液1:1組對SGC-7901的藥理活性最強(qiáng),但與陽性藥鹽酸阿霉素相差很大。后通過譜效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn),黃酮部位與藥對水煎液對SGC-7901的藥理活性關(guān)系密切,可認(rèn)為黃酮部位是藥對抑制殺傷SGC-7901的有效部位。應(yīng)用大孔樹脂法篩選出的純化工藝可有效富集藥對(配伍比例1:1)、白花蛇舌草和半枝蓮中的黃酮,提取物中黃酮含量較高,且工藝穩(wěn)定。結(jié)果顯示黃酮提取物的體外抗腫瘤活性顯著,與鹽酸阿霉素相當(dāng),具有開發(fā)成藥價(jià)值。
【學(xué)位單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R284;R285
【部分圖文】：

1 藥材概述半枝蓮（Scutellaria barbata D.Don），又名狹葉并頭草、韓信草、牙刷草等，唇形科黃芩屬植物半枝蓮的干燥全草，如圖 1-1 所示。2015 年版《中國藥典》中記載半枝蓮性味辛、苦、寒，歸肺、肝、腎經(jīng)，有解毒清熱、利尿化瘀等功效，用于咽喉腫痛，蛇蟲咬傷、跌撲傷痛。半枝蓮喜溫暖濕潤的生長環(huán)境，常生于溪邊、水田邊和濕潤的草地上，主要分布在河北、河南、山東、江蘇、浙江、廣東等地，泰國、尼泊爾、緬甸等國家也有分布。白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd），又名蛇舌草、白花十字草、蛇舌癀等，茜草科耳草屬植物白花蛇舌草的干燥全草，如圖 1-2 所示�！稄V西中藥志》中記載白花蛇舌草性味苦、甘、寒，歸心、肝、脾經(jīng)，有清熱、利濕、解毒等功效，用于肺熱喘咳、咽喉炎、毒蛇咬傷、痢疾等。白花蛇舌草常生長于山地巖石、田埂和濕潤的曠地。主要分布在廣東、廣西、福建、云南、海南、安徽等地，日本、尼泊爾等國家也有分布。

1 藥材概述半枝蓮（Scutellaria barbata D.Don），又名狹葉并頭草、韓信草、牙刷草等，唇形科黃芩屬植物半枝蓮的干燥全草，如圖 1-1 所示。2015 年版《中國藥典》中記載半枝蓮性味辛、苦、寒，歸肺、肝、腎經(jīng)，有解毒清熱、利尿化瘀等功效，用于咽喉腫痛，蛇蟲咬傷、跌撲傷痛。半枝蓮喜溫暖濕潤的生長環(huán)境，常生于溪邊、水田邊和濕潤的草地上，主要分布在河北、河南、山東、江蘇、浙江、廣東等地，泰國、尼泊爾、緬甸等國家也有分布。白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd），又名蛇舌草、白花十字草、蛇舌癀等，茜草科耳草屬植物白花蛇舌草的干燥全草，如圖 1-2 所示。《廣西中藥志》中記載白花蛇舌草性味苦、甘、寒，歸心、肝、脾經(jīng)，有清熱、利濕、解毒等功效，用于肺熱喘咳、咽喉炎、毒蛇咬傷、痢疾等。白花蛇舌草常生長于山地巖石、田埂和濕潤的曠地。主要分布在廣東、廣西、福建、云南、海南、安徽等地，日本、尼泊爾等國家也有分布。

將 PDA 定性為黃酮類成分的色譜峰峰面積加和，代入對照品質(zhì)量-峰面積線性回歸方程，計(jì)算總黃酮含量。該方法利用 PDA 定性黃酮類成分，專屬性與準(zhǔn)確度均優(yōu)于傳統(tǒng)的紫外比色法。2.2.1.1 色譜條件色譜柱：AcQuity UPLC HSS T3 C18（2.1×100mm，1.8μm）；體積流量：0.3mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：333nm（野黃芩苷）、253nm（蘆丁）；進(jìn)樣體積：1μL；流動相：乙腈（A）-0.5%甲酸，梯度洗脫（0～5min，10%A；5～18min，10→16%A；18～22min，16%A；22～32min，16→19%A；32～50min，19→32%A）。2.2.1.2 專屬性考察（1）乙醇合提藥液的專屬性考察：精密吸取藥對乙醇合提藥液、白花蛇舌草與半枝蓮乙醇單提藥液適量，按“2.2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，將譜圖中各色譜峰歸屬至白花蛇舌草或半枝蓮，結(jié)果見圖 2-1。
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本文編號：2871729