目的探討黃芪多糖通過(guò)DNA損傷修復(fù)發(fā)揮抗非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)活性的作用及機(jī)制。方法通過(guò)ip氨基甲酸酯(0.8 mg/g)建立NSCLC小鼠模型,觀察肺組織表面結(jié)節(jié)的數(shù)量及形態(tài)在體評(píng)價(jià)黃芪多糖(300 mg/kg)的抗腫瘤活性;CCK8法評(píng)價(jià)黃芪多糖體外抗人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549(40.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.25μmol/L)和HCC827(100、50、25μmol/L)增殖活性;并通過(guò)單細(xì)胞凝膠電泳測(cè)定(彗星試驗(yàn))評(píng)價(jià)黃芪多糖對(duì)A549(40μmol/L)和HCC827(50μmol/L)細(xì)胞DNA損傷的影響;通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)、Western blotting、RNA干擾、免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)研究黃芪多糖對(duì)VRK1/P53BP1信號(hào)通路的作用。結(jié)果與模型組小鼠比較,黃芪多糖和吉非替尼(陽(yáng)性藥)組的結(jié)節(jié)數(shù)目顯著減少(P0.05、0.01);黃芪多糖組的腫瘤結(jié)節(jié)呈近似圓形,與緊密排列的腫瘤結(jié)節(jié)邊界清晰,模型和吉非替尼組的結(jié)節(jié)呈現(xiàn)不規(guī)則結(jié)構(gòu),細(xì)胞排列松散,更具侵略性。黃芪多糖呈劑量相關(guān)性地抑制A549和HCC827細(xì)胞增殖,顯著縮短的彗尾和橄欖炬(P0.05、0.001),保護(hù)DNA完整性;顯著增加NSCLC細(xì)胞中VRK1 mRNA和蛋白表達(dá)水平(P0.05、0.01),同時(shí)免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)P53BP1和VRK1蛋白表達(dá)水平升高,且VRK1蛋白可在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間移位;通過(guò)VRK1敲低反向驗(yàn)證上述結(jié)果。結(jié)論黃芪多糖通過(guò)激活VRK1/P53BP1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑增強(qiáng)DNA損傷修復(fù),進(jìn)而抑制NSCLC細(xì)胞增殖。
【部分圖文】：

通過(guò)siRNA干擾降低HCC827細(xì)胞中VRK1表達(dá)，明確黃芪多糖對(duì)VRK1的潛在影響。RT-qPCR結(jié)果表明（圖4A），與NC組比較，黃芪多糖可顯著增加VRK1 mRNA表達(dá)水平（P<0.01）；而VRK1-KD組和VRK1-KD+黃芪多糖組之間VRK1 mRNA水平無(wú)顯著差異。Western blotting分析得出相似的結(jié)果（圖4B）。CCK8測(cè)定表明（圖4C),VRK1敲低后，黃芪多糖對(duì)HCC827細(xì)胞的抑制率顯著降低（P<0.05）。結(jié)果表明，黃芪多糖可通過(guò)上調(diào)VRK1表達(dá)抑制HCC827細(xì)胞的增殖。圖3 黃芪多糖對(duì)VRK1和P53BP1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響（±s,n=3)

圖2 黃芪多糖對(duì)細(xì)胞增殖和DNA完整性的影響（±s,n=3)彗星實(shí)驗(yàn)（圖4D、E、F）表明，與NC組和VRK1-KD組比較，黃芪多糖處理后，彗尾長(zhǎng)度和彗星橄欖炬均顯著減�。≒<0.001）。與VRK1-KD+黃芪多糖組比較，NC+黃芪多糖組的彗尾長(zhǎng)度（P<0.001）和彗星橄欖炬（P<0.05）均顯著減小，進(jìn)一步證實(shí)黃芪多糖可保護(hù)DNA完整性，而VRK1敲低后作用下降。

NSCLC的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多個(gè)因素、階段和步驟，其主要致病機(jī)制是由于各種因素所致的原癌基因的激活或抗癌基因的失活，包括DNA損傷修復(fù)能力受損。由DNA損傷引起的壓力的細(xì)胞反應(yīng)對(duì)于維持遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性、防止基因突變和維持細(xì)胞功能尤為重要[9]。環(huán)境因素引起的DNA損傷是正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞的關(guān)鍵因素之一，而細(xì)胞對(duì)DNA損傷的反應(yīng)可預(yù)防腫瘤發(fā)生。大量研究表明，DNA修復(fù)系統(tǒng)的過(guò)度激活可以促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[19-20]。因此，DNA損傷修復(fù)活性在腫瘤中具有雙重作用。由于植物來(lái)源的天然產(chǎn)物可提供大量候選藥物，因此一直是人們研究的焦點(diǎn)。而且，大多數(shù)抗癌中藥不會(huì)像化學(xué)治療藥物一樣引發(fā)DNA損傷或致癌作用。黃芪作為傳統(tǒng)中草藥，具益氣固表、利水消腫等功效，其所包含的黃芪多糖成分具有多重活性，包括免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤等作用，已有研究表明，黃芪多糖具有抗非小細(xì)胞肺癌作用，然而其在非小細(xì)胞肺癌的DNA損傷和修復(fù)活性中的關(guān)系尚不清楚。本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)明確黃芪多糖可增強(qiáng)DNA損傷修復(fù)以保護(hù)DNA完整性。DNA損傷反應(yīng)受VRK1/P53BP1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控[21],VRK1參與DNA損傷后的早期細(xì)胞反應(yīng)，它可以激活P53BP1來(lái)微調(diào)DNA的檢測(cè)和修復(fù)過(guò)程。同時(shí)有研究表明VRK1參與細(xì)胞分裂，并在細(xì)胞周期G0-G1/S階段起著重要作用，VRK1表達(dá)降低可抑制細(xì)胞周期進(jìn)程[22]。此外，VRK1可調(diào)節(jié)染色體濃度和DNA損傷反應(yīng)，與正常細(xì)胞相比，VRK1與肺腺癌細(xì)胞基因網(wǎng)絡(luò)中的有絲分裂基因顯著相關(guān)[23]。VRK1的底物包括酪蛋白、組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和端粒維持蛋白，VRK1還可與DNA修復(fù)相關(guān)蛋白（如P53BP1和P53）形成穩(wěn)定的復(fù)合物，進(jìn)而在細(xì)胞核中包圍所有DNA[24]。因此，由DNA損傷引起的染色質(zhì)局部變形可能被VRK1捕獲。本研究通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，探討黃芪多糖在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中對(duì)DNA損傷和修復(fù)活性的調(diào)節(jié)作用和機(jī)制。對(duì)腫瘤的發(fā)生率和病理學(xué)特征的分析表明，黃芪多糖可以減少DNA損傷并抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲性，抑制腫瘤進(jìn)展，并使用專門(mén)評(píng)估DNA損傷的彗星試驗(yàn)證實(shí)了這一現(xiàn)象。盡管許多化學(xué)治療藥物通過(guò)破壞DNA來(lái)殺死和抑制腫瘤細(xì)胞，但是通過(guò)增加特異性DNA保護(hù)并不會(huì)促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，相反，其可抑制腫瘤活性，并減緩腫瘤的發(fā)展和侵襲性。黃芪多糖可顯著增加VRK1表達(dá)，這可能是黃芪多糖對(duì)DNA損傷修復(fù)的影響的關(guān)鍵因素。P53bp1作為下游蛋白，與VRK1介導(dǎo)的DNA損傷和修復(fù)過(guò)程相關(guān)，Western blotting和免疫熒光測(cè)定驗(yàn)證黃芪多糖可上調(diào)該蛋白表達(dá)，表明黃芪多糖通過(guò)上調(diào)VRK1的表達(dá)和P53BP1灶的形成來(lái)促進(jìn)DNA修復(fù)，并通過(guò)細(xì)胞中VRK1敲低實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果。
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