龜甲和鱉甲為臨床常用動物類中藥,龜甲為龜科動物烏龜?shù)谋臣准案辜?具有滋陰潛陽、益腎強(qiáng)骨、養(yǎng)血補(bǔ)心、固經(jīng)止崩等功效;鱉甲為鱉科動物鱉的背甲,具有滋陰潛陽、退熱除蒸、軟堅散結(jié)等功效。近年來由于需求量大、同名異物、民間用藥差異、親緣物種的形態(tài)學(xué)特征相似以及專業(yè)鑒定經(jīng)驗(yàn)的缺乏等原因,市面上出現(xiàn)了一些龜甲與鱉甲的偽品,對臨床用藥的安全性和有效性造成了負(fù)面影響。雖然研究者開展了龜甲與鱉甲藥材及原動物的鑒定研究工作,但對其飲片及摻偽品的鑒定尚未深入研究,應(yīng)用范圍較為局限。本論文根據(jù)龜甲與鱉甲及其常見偽品基原的線粒體全基因序列的差異設(shè)計了引物,并基于特異性擴(kuò)增建立了一種專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確方便地鑒定龜甲與鱉甲藥材和飲片的技術(shù),可為監(jiān)控市面產(chǎn)品的質(zhì)量提供方法,有助于維護(hù)市場秩序,有利于保障臨床用藥的安全性與有效性,因而具有重要的應(yīng)用價值,同時亦可為動物藥的專屬性鑒定提供一條新的途徑。主要研究內(nèi)容包括:1.首先根據(jù)全基因組序列的差異設(shè)計并篩選出了龜甲與鱉甲及三種常見偽品的5對特異性引物,繼而采用SDS法、酚仿抽提法從新鮮龜甲與鱉甲中提取與純化DNA,并通過改變PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序?qū)CR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,在最優(yōu)條件下進(jìn)行特異性驗(yàn)證及靈敏度考察。結(jié)果顯示,龜甲與鱉甲及其常見偽品巴西龜、花龜、佛羅里達(dá)鱉的DNA經(jīng)擴(kuò)增后分別在120 bp、120 bp、81 bp、105 bp、114 bp處產(chǎn)生條帶,且未觀察到引物間有交叉反應(yīng),體現(xiàn)出很強(qiáng)的專屬性,可見所建立的特異性引物擴(kuò)增技術(shù)可用于鑒定龜甲與鱉甲的真?zhèn)�。另�?利用該方法時,五個物種的DNA的檢出限均為1 ng,并且摻偽品中相應(yīng)的基原物種均被準(zhǔn)確檢出。本章節(jié)的研究為此后龜甲與鱉甲的藥材、飲片的鑒定研究奠定了基礎(chǔ)。2.自制龜甲與鱉甲藥材及生品,進(jìn)而考察所建立的特異性引物擴(kuò)增技術(shù)是否能夠應(yīng)用于鑒定這些藥材及生品。此外,利用所建立的方法對市售的龜甲、鱉甲藥材與生品進(jìn)行鑒定,并依照判別標(biāo)準(zhǔn)對真?zhèn)巍絺巫龀雠袛�。結(jié)果顯示,自制及市售藥材與生品均擴(kuò)增出與目的片段相一致的條帶,可見采用該技術(shù)不僅可以成功地鑒定龜甲與鱉甲的原材料、藥材,而且能夠鑒定經(jīng)過較長時間加熱而制備得到的生品。3.自制龜甲與鱉甲醋制品,考察所建立的特異性引物擴(kuò)增技術(shù)是否能夠應(yīng)用于鑒定經(jīng)過深度加工的炮制品,并對市售醋龜甲和醋鱉甲進(jìn)行鑒定。此后,利用熒光定量PCR進(jìn)一步提高鑒定技術(shù)的檢測靈敏度。結(jié)果表明,熒光定量PCR鑒定技術(shù)能夠從全部自制醋龜甲與醋鱉甲中檢出相應(yīng)物種,檢測效果明顯優(yōu)于常規(guī)PCR,但未能全部檢出市售醋龜甲與醋鱉甲中的相應(yīng)物種。與此同時,比較了不同試劑盒對炮制品DNA模板的提取與純化效果,結(jié)果表明,三種試劑盒法均有利于制備具有高擴(kuò)增效率的DNA模板,其中Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒效果最好,磁珠法微量基因組DNA抽提試劑盒次之。4.首先對動物藥鑒定數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了框架設(shè)計,進(jìn)而利用Access對數(shù)據(jù)表進(jìn)行欄目的設(shè)計以及數(shù)據(jù)的錄入,以Visual Studio進(jìn)行窗體的設(shè)計,并通過添加ADODC控件,在Visual Studio代碼窗口中輸入相應(yīng)的代碼將窗體與Access目標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行連接。最后,通過SQL語句實(shí)現(xiàn)動物藥基本信息、特異性引物信息、樣品信息的檢索功能。最終初步構(gòu)建了動物藥鑒定數(shù)據(jù)庫,有助于進(jìn)一步開發(fā)網(wǎng)絡(luò)共享平臺,可為動物藥的鑒定研究提供技術(shù)參數(shù)和數(shù)據(jù)支持,并為動物藥的真?zhèn)伪孀R提供便利。
【學(xué)位單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R282.74;R284.1
【部分圖文】：

第一章 緒論1.1 概述龜甲（Testudinis Carapax ET Plastrum，TCP）和鱉甲（Trionycis Carapax，TC）為臨床常用動物類中藥（圖 1.1）。龜甲為龜科（Testudinidae）動物烏龜 Chinemys reevesii(Gray)（CR）的背甲及腹甲，其性微寒，味咸甘，歸肝、腎、心經(jīng)，具有滋陰潛陽、益腎強(qiáng)骨、養(yǎng)血補(bǔ)心、固經(jīng)止崩等功效[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，龜甲具有增強(qiáng)免疫功能、抗缺血、抗凋亡、延緩衰老、解熱鎮(zhèn)靜、興奮子宮、促進(jìn)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞增殖、抗帕金森病等作用[2]。鱉甲為鱉科（Trionychidae）動物鱉 Pelodiscus sinensis Wiegmann（PS）的背甲，其性微寒，味咸，歸肝、腎經(jīng)，具有滋陰潛陽、退熱除蒸、軟堅散結(jié)的功效[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，鱉甲具有抗肝纖維化、抗癌、治療肺纖維化、增強(qiáng)免疫、降低血脂等作用[2]。

本論文的技術(shù)路線

體積的三氯甲烷-異戊醇（24:1），充分混勻，12000 rpm 離心 10 min 倍體積的 5 M 乙酸鉀溶液和 2 倍體積的預(yù)冷 96%乙醇，充分混合，-2m 離心 15 mins，棄去廢液；沉淀中加入預(yù)冷的 70%乙醇 500 μL 洗滌 15 mins，棄去廢液；室溫晾干，以 25 μL TE 緩沖液溶解，得到 DNA檢查，4℃下保存，備用。異性引物的設(shè)計 CR（NC_006082.1、AY676201.1、FJ469674.1、KJ700438.1）、PS（NC_85.1、AY962573.1）及其常見偽品巴西龜 Trachemys scripta（TS）（NC_4.1、KM216749.1）、花龜 Mauremys sinensis（MS）（NC_016685.1、FJ50.1）和佛羅里達(dá)鱉 Apalone ferox（AF）（NC_014054.1、FJ890514.1用 Oligo 7 軟件設(shè)計特異性引物，并通過 NCBI Primer-BLAST 評估，如表 2.4 所示，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2866488