發(fā)布時間：2020-10-31 12:30

　　 目的觀察補青顆粒調(diào)控“線粒體自噬”相關(guān)信號通路改善高糖誘導的SRA01/04細胞損傷及其分子機制,為補青顆粒治療糖尿病性白內(nèi)障的臨床應用提供實驗依據(jù)。方法1.按照血清藥理學方法制備實驗所需含藥血清。將SD大鼠隨機分為5組:空白對照組(10mL·kg-1蒸餾水)、陽性對照組(1 g·m L-1杞菊地黃丸水溶液)、補青顆粒高、中、低濃度組(4g·m L-1、2g·m L-1、1g·mL-1補青顆粒水溶液),每組15只,bid灌胃給藥,連續(xù)給藥7d,于末次給藥1h后腹主動脈采血,3000rpm·min-1條件下高速離心制備含藥血清。2.采用永生化人晶狀體上皮細胞(SRA01/04)培養(yǎng)制備高糖模型。將SRA01/04細胞分成6組,根據(jù)本課題組前期研究成果,以30mmol·L-1葡萄糖濃度為最適細胞增殖濃度,用以模擬高糖環(huán)境分別干預各實驗組,即10%空白血清組、高糖+10%空白血清組、高糖+10%杞菊地黃丸含藥血清組、高糖+10%補青顆粒高、中、低濃度含藥血清組(4、2、1 g·m L-1)。采用CCK-8法檢測不同含藥血清對高糖誘導的SRA01/04細胞24h增殖活力的影響。3.以各實驗組含藥血清干預高糖模型。分別采用免疫熒光技術(shù)觀察各組細胞中線粒體自噬相關(guān)蛋白Parkin、Pink-1、P62的表達;采用Western bolt檢測各組細胞中線粒體自噬相關(guān)蛋白Parkin、Pink-1、P62、Bnip3、Nix表達的變化;采用Real-time PCR法檢測LC3-Ⅱ和LC3-ⅠmRNA的表達。結(jié)果1.CCK-8結(jié)果顯示高糖誘導下SRA01/04細胞增殖活力異常升高,不同濃度補青顆粒含藥血清對高糖誘導SRA01/04細胞增殖活力均有抑制作用,且以中濃度含藥血清干預時,抑制作用顯著(P0.05)。2.免疫熒光檢測結(jié)果顯示不同含藥血清組SRA01/04細胞內(nèi)均可見與線粒體自噬相關(guān)的蛋白Pink-1、Parkin、P62表達,且多于細胞質(zhì)中表達,不同含藥血清組上述蛋白表達量存在差異。3.Western bolt檢測結(jié)果顯示,在對Pink-1/Parkin信號通路研究中發(fā)現(xiàn),高糖誘導下SRA01/04細胞可見線粒體自噬相關(guān)蛋白Pink-1、Parkin及P62的表達,給予補青顆粒含藥血清干預后Pink-1、Parkin表達增高(P0.01),P62表達降低(P0.01);在對Bnip3/Nix信號通路研究中發(fā)現(xiàn),高糖誘導下SRA01/04細胞可見Bnip3、Nix表達,且隨損傷時間延長呈先增后減趨勢,以損傷后24h達高峰,給予補青顆粒含藥血清干預后,上述表達趨勢更顯著(P0.01),且作用時間延長(P0.01)。4.Real-time PCR檢測結(jié)果顯示不同含藥血清組SRA01/04細胞內(nèi)均可見微管相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ與LC3-ⅠmRNA表達,且LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比值呈先增后減趨勢,并于損傷后24h時達高峰,給予補青顆粒含藥血清干預后,上述趨勢更明顯(P0.01),且作用時間延長(P0.01)。結(jié)論補青顆粒能有效抑制高糖誘導下SRA01/04細胞的增殖,減輕因SRA01/04細胞過度增殖而導致的晶狀體混濁,其機制可能與干預損傷后線粒體自噬相關(guān)蛋白的動態(tài)表達有關(guān)。
【學位單位】：寧夏醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

檢測補青顆粒含藥血清對高糖誘導人晶狀體上皮細胞線粒n、P62 表達的影響下各組人晶狀體上皮細胞中均可見 Pink-1、Parkin、P62 表胞核形成折光性較強的圓形或梭形表達，且大多位于細胞質(zhì)所示，模型組 Pink-1、Parkin 表達較空白對照組增多，P62-1、Parkin 表達較模型組增多，P62 表達減少；而補青顆粒中菊地黃丸組增多，P62 表達減少（見圖 2-4）。

量顯著增高(P<0.01)。見表 3，圖 6。表 3 各組細胞中 Parkin 蛋白表達（x s，n=10）Table3 protein expression levels of cyclin protein Parkin in each group（x s，n=10）組別 劑量/g·mL-1時間點/h Parkin空白組 - 24 0.729±0.106模型組 - - 1.044±0.1972)杞菊地黃丸組 1.0 - 1.353±0.1064)補青顆粒中濃度組 2.0 - 1.882±0.1764,6)空白組比較1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較3)P<0.05，4)P<0.01；與杞菊地黃丸P<0.01。

見表 4，圖 7。表 4 各組細胞中 P62 蛋白表達（x s，n=10）Table 4 protein expression levels of cyclin protein P62 in each group（x s，n=10）組別 劑量/g·mL-1時間點/h P62空白組 - 24 0.638±0.137模型組 - - 0.434±0.0851)杞菊組 1.0 - 0.288±0.0134)補青顆粒中濃度組 2.0 - 0.211±0.0894,6)空白組比較1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較3)P<0.05，4)P<0.01；與杞菊地)P<0.01。
【參考文獻】

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本文編號：2863952