發(fā)布時(shí)間：2020-10-31 12:30

　　 目的觀察補(bǔ)青顆粒調(diào)控“線粒體自噬”相關(guān)信號(hào)通路改善高糖誘導(dǎo)的SRA01/04細(xì)胞損傷及其分子機(jī)制,為補(bǔ)青顆粒治療糖尿病性白內(nèi)障的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法1.按照血清藥理學(xué)方法制備實(shí)驗(yàn)所需含藥血清。將SD大鼠隨機(jī)分為5組:空白對(duì)照組(10mL·kg-1蒸餾水)、陽性對(duì)照組(1 g·m L-1杞菊地黃丸水溶液)、補(bǔ)青顆粒高、中、低濃度組(4g·m L-1、2g·m L-1、1g·mL-1補(bǔ)青顆粒水溶液),每組15只,bid灌胃給藥,連續(xù)給藥7d,于末次給藥1h后腹主動(dòng)脈采血,3000rpm·min-1條件下高速離心制備含藥血清。2.采用永生化人晶狀體上皮細(xì)胞(SRA01/04)培養(yǎng)制備高糖模型。將SRA01/04細(xì)胞分成6組,根據(jù)本課題組前期研究成果,以30mmol·L-1葡萄糖濃度為最適細(xì)胞增殖濃度,用以模擬高糖環(huán)境分別干預(yù)各實(shí)驗(yàn)組,即10%空白血清組、高糖+10%空白血清組、高糖+10%杞菊地黃丸含藥血清組、高糖+10%補(bǔ)青顆粒高、中、低濃度含藥血清組(4、2、1 g·m L-1)。采用CCK-8法檢測(cè)不同含藥血清對(duì)高糖誘導(dǎo)的SRA01/04細(xì)胞24h增殖活力的影響。3.以各實(shí)驗(yàn)組含藥血清干預(yù)高糖模型。分別采用免疫熒光技術(shù)觀察各組細(xì)胞中線粒體自噬相關(guān)蛋白Parkin、Pink-1、P62的表達(dá);采用Western bolt檢測(cè)各組細(xì)胞中線粒體自噬相關(guān)蛋白Parkin、Pink-1、P62、Bnip3、Nix表達(dá)的變化;采用Real-time PCR法檢測(cè)LC3-Ⅱ和LC3-ⅠmRNA的表達(dá)。結(jié)果1.CCK-8結(jié)果顯示高糖誘導(dǎo)下SRA01/04細(xì)胞增殖活力異常升高,不同濃度補(bǔ)青顆粒含藥血清對(duì)高糖誘導(dǎo)SRA01/04細(xì)胞增殖活力均有抑制作用,且以中濃度含藥血清干預(yù)時(shí),抑制作用顯著(P0.05)。2.免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示不同含藥血清組SRA01/04細(xì)胞內(nèi)均可見與線粒體自噬相關(guān)的蛋白Pink-1、Parkin、P62表達(dá),且多于細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),不同含藥血清組上述蛋白表達(dá)量存在差異。3.Western bolt檢測(cè)結(jié)果顯示,在對(duì)Pink-1/Parkin信號(hào)通路研究中發(fā)現(xiàn),高糖誘導(dǎo)下SRA01/04細(xì)胞可見線粒體自噬相關(guān)蛋白Pink-1、Parkin及P62的表達(dá),給予補(bǔ)青顆粒含藥血清干預(yù)后Pink-1、Parkin表達(dá)增高(P0.01),P62表達(dá)降低(P0.01);在對(duì)Bnip3/Nix信號(hào)通路研究中發(fā)現(xiàn),高糖誘導(dǎo)下SRA01/04細(xì)胞可見Bnip3、Nix表達(dá),且隨損傷時(shí)間延長呈先增后減趨勢(shì),以損傷后24h達(dá)高峰,給予補(bǔ)青顆粒含藥血清干預(yù)后,上述表達(dá)趨勢(shì)更顯著(P0.01),且作用時(shí)間延長(P0.01)。4.Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示不同含藥血清組SRA01/04細(xì)胞內(nèi)均可見微管相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ與LC3-ⅠmRNA表達(dá),且LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比值呈先增后減趨勢(shì),并于損傷后24h時(shí)達(dá)高峰,給予補(bǔ)青顆粒含藥血清干預(yù)后,上述趨勢(shì)更明顯(P0.01),且作用時(shí)間延長(P0.01)。結(jié)論補(bǔ)青顆粒能有效抑制高糖誘導(dǎo)下SRA01/04細(xì)胞的增殖,減輕因SRA01/04細(xì)胞過度增殖而導(dǎo)致的晶狀體混濁,其機(jī)制可能與干預(yù)損傷后線粒體自噬相關(guān)蛋白的動(dòng)態(tài)表達(dá)有關(guān)。
【學(xué)位單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

檢測(cè)補(bǔ)青顆粒含藥血清對(duì)高糖誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞線粒n、P62 表達(dá)的影響下各組人晶狀體上皮細(xì)胞中均可見 Pink-1、Parkin、P62 表胞核形成折光性較強(qiáng)的圓形或梭形表達(dá)，且大多位于細(xì)胞質(zhì)所示，模型組 Pink-1、Parkin 表達(dá)較空白對(duì)照組增多，P62-1、Parkin 表達(dá)較模型組增多，P62 表達(dá)減少；而補(bǔ)青顆粒中菊地黃丸組增多，P62 表達(dá)減少（見圖 2-4）。

量顯著增高(P<0.01)。見表 3，圖 6。表 3 各組細(xì)胞中 Parkin 蛋白表達(dá)（x s，n=10）Table3 protein expression levels of cyclin protein Parkin in each group（x s，n=10）組別 劑量/g·mL-1時(shí)間點(diǎn)/h Parkin空白組 - 24 0.729±0.106模型組 - - 1.044±0.1972)杞菊地黃丸組 1.0 - 1.353±0.1064)補(bǔ)青顆粒中濃度組 2.0 - 1.882±0.1764,6)空白組比較1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較3)P<0.05，4)P<0.01；與杞菊地黃丸P<0.01。

見表 4，圖 7。表 4 各組細(xì)胞中 P62 蛋白表達(dá)（x s，n=10）Table 4 protein expression levels of cyclin protein P62 in each group（x s，n=10）組別 劑量/g·mL-1時(shí)間點(diǎn)/h P62空白組 - 24 0.638±0.137模型組 - - 0.434±0.0851)杞菊組 1.0 - 0.288±0.0134)補(bǔ)青顆粒中濃度組 2.0 - 0.211±0.0894,6)空白組比較1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較3)P<0.05，4)P<0.01；與杞菊地)P<0.01。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2863952