缺血性中風是因栓塞或者血栓引起的大腦中血管阻塞。缺血性中風發(fā)生后的炎癥反應會加重繼發(fā)的神經元損傷,不利于大腦功能的恢復。小膠質細胞是大腦中的常駐免疫效應細胞,在生理情況下持續(xù)監(jiān)測大腦中的微環(huán)境。一旦局部缺血發(fā)生以后,小膠質細胞被迅速激活,激活后的小膠質細胞按照分泌因子和表面標記物的不同被定義為激活型小膠質細胞(M1型)和選擇性激活型小膠質細胞(M2型),其中M1型小膠質細胞主要發(fā)揮促炎和神經毒性作用,M2型小膠質細胞主要發(fā)揮抗炎和神經保護作用。小膠質細胞參與腦缺血后炎癥反應的發(fā)生、發(fā)展和轉歸,其表型轉換與炎癥反應密切相關。目前,清開靈注射液在缺血性中風后抗炎作用的潛在機制尚未被徹底闡明。本課題基于小膠質細胞表型變化探究清開靈注射液對腦缺血大鼠的抗炎作用機制,為研究中藥制劑提供實驗依據。目的(1)證明清開靈注射液對MCAO大鼠的腦保護作用及抗炎作用。(2)基于小膠質細胞表型變化探究清開靈注射液對MCAO大鼠的抗炎作用機制。方法(1)健康雄性清潔級Sprague-Dawley大鼠,體重210-230g,隨機分為三組,分別為:假手術組、模型組(0.9ml/100g)、清開靈組(0.9ml/100g)。模型組和清開靈組用線栓法制備大腦中動脈阻塞(MCAO)模型,假手術組暴露并分離血管,但不插入線栓。清開靈組在MCAO同時腹腔注射用2倍生理鹽水稀釋后的清開靈注射液,缺血后4小時第二次給藥。從第二天開始,每天給藥2次,中間間隔12小時。假手術組和模型組腹腔注射等體積的生理鹽水。在MCAO后24小時采用Bederson神經功能評分評定大鼠神經功能缺損情況,用TTC染色法測定大鼠腦梗死體積,用HE染色法觀察大鼠大腦缺血灶周圍組織病理形態(tài)變化。通過酶聯免疫吸附法(Elisa)檢測大鼠腦組織中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達水平,用Western blot法檢測NF-κB通路p-p65/p65和p-IkBa的變化,觀察缺血性中風后清開靈注射液對NF-κB信號通路的作用以及對促炎細胞因子的影響。(2)健康雄性清潔級Sprague-Dawley大鼠,體重210-230g,隨機分為三組,分別為:假手術組、模型組(0.9ml/100g)、清開靈組(0.9ml/100g)。模型組和清開靈組制備MCAO模型,假手術組暴露并分離血管,但不插入線栓。清開靈組在MCAO同時腹腔注射用2倍生理鹽水稀釋的清開靈注射液,缺血后4小時第二次給藥,從第二天起每天給藥2次,中間間隔12小時。假手術組和模型組腹腔注射等體積的生理鹽水。在MCAO后24小時通過雙重免疫熒光染色法觀察M1型小膠質細胞標記物CD16和M2型小膠質細胞標記物CD206的表達。利用Q-PCR進一步檢測M1型小膠質細胞特異性蛋白CD16、CD32、iNOS以及M2型小膠質細胞特異性蛋白CD206、TGF-β的mRNA的表達,通過觀察小膠質細胞表型變化探究清開靈注射液對腦缺血大鼠的抗炎作用機制。結果(1)神經功能評分:假手術組大鼠無神經功能損傷,模型組和清開靈組大部分大鼠出現左側偏癱,身體向左側打轉,懸尾時左側前肢不能完全伸直,內收并貼近胸壁。與假手術組相比,模型組大鼠神經功能評分顯著升高(P0.01);給予清開靈注射液治療后,與模型組相比,大鼠神經功能評分顯著降低(P0.01),神經功能有一定程度的恢復。(2)TTC染色:假手術組大鼠腦組織呈現均勻的玫瑰紅色;與假手術組相比,模型組大鼠腦組織呈現明顯的白色缺血灶(P0.01);給予清開靈注射液治療后,與模型組相比,清開靈組大鼠的腦梗死體積顯著減小(P0.01)。(3)HE染色:假手術組大鼠腦組織結構完整,神經元細胞排列整齊有序,胞漿豐富,淡染,胞核大,核仁清晰。膠質細胞結構完整,排列整齊。模型組大鼠腦組織可見大片梗死灶,神經細胞大片消失,數量減少,排列紊亂,梗死灶周圍膠質細胞明顯增生,壞死邊緣狹窄,中性粒細胞大量浸潤。清開靈組大鼠腦梗死區(qū)面積顯著減少,神經元數目減少程度低,輕度變性,膠質細胞增生不明顯,邊緣區(qū)增寬。(4)對NF-κB通路以及促炎因子的影響:大鼠大腦中動脈阻塞后,與假手術組相比,模型組促炎因子TNF-α(P0.01)、IL-1β(P0.01)、IL-6(P0.01)的表達明顯升高;給藥后,與模型組相比,清開靈注射液可以抑制三種促炎因子TNF-α(P0.01)、IL-1β(P0.05)、IL-6(P0.05)的表達,此外清開靈注射液降低了p-p65/p65的比值(P0.05),抑制了p-IkBa(P0.05)的表達。證明清開靈注射液能夠抑制NF-κB通路的激活,抑制促炎因子的分泌,抗缺血后炎癥。(5)雙重免疫熒光染色及Q-PCR:雙重免疫熒光染色結果顯示清開靈注射液抑制MCAO后M1型小膠質細胞的標記物CD16(P0.01)的表達,升高M2型小膠質細胞標記物CD206(P0.01)的表達。Q-PCR結果顯示清開靈注射液能夠降低M1型小膠質細胞蛋白標記物CD16、CD32、iNOS的mRNA表達,升高M2型小膠質細胞蛋白標記物CD206、TGF-β的mRNA表達。結論(1)清開靈注射液可以減少MCAO大鼠腦梗死體積,降低大鼠神經功能評分,改善大鼠腦組織的病理損害,清開靈注射液能夠抑制NF-κB通路的激活,減少促炎細胞因子的分泌,抑制缺血再灌注損傷大鼠的炎癥反應,發(fā)揮腦保護作用。(2)清開靈注射液可以抑制M1型小膠質細胞標記物CD16的表達,促進M2型小膠質細胞標記物CD206的表達,降低M1型小膠質細胞特異性蛋白CD16、CD32、iNOS的mRNA的表達,上調M2型小膠質細胞特異性蛋白CD206、TGF-β的mRNA的表達,促進小膠質細胞向有益的表型M2型轉換。清開靈注射液能夠通過調控小膠質細胞表型發(fā)揮抗炎作用。其對小膠質細胞表型的調控可能與抑制NF-κB通路激活,降低促炎因子分泌有關。
【學位單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

各組大鼠神經功能評分

經過TTC染色,腦梗死區(qū)呈現白色,正常組織被染成玫瑰紅色。從圖1-2可以看到模型組出現明顯的梗死灶。實驗結果表明,與空白組相比,模型組大鼠腦組織出現明顯的缺血灶(P<0.01);與模型組相比,清開靈組能明顯減少腦梗死體積(P<0.01)。結果見表2,圖2和圖3。圖3 各組大鼠腦梗死體積(%)

各組大鼠腦梗死體積(%)
【參考文獻】

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1 劉松;;醒腦靜注射液對急性缺血性中風患者hs-CRP、IL-6及TC水平的影響[J];神經藥理學報;2015年05期

2 李振爽;翟宏偉;楊永勤;徐江;;熄風祛痰化瘀通絡法治療急性腦梗死療效觀察[J];中國中醫(yī)急癥;2015年04期

3 邸杰;崔春霞;劉鐘;王秀芹;姜全心;;化痰通腑瀉熱方加減辨治缺血性中風急性期的臨床研究[J];中國中醫(yī)急癥;2015年04期

4 林錫豐;;熄風化痰通絡湯治療60例缺血性中風的療效觀察[J];中國實用醫(yī)藥;2015年09期

5 葉愛萍;王鍵;胡建鵬;;試論腦中風從調理氣血論治[J];遼寧中醫(yī)藥大學學報;2015年02期

6 靳建宏;白冠鋒;;補腎化痰逐瘀法治療缺血性中風60例[J];中醫(yī)研究;2014年09期

7 劉志軍;楊瑞龍;楊濤;胡敏棣;竇友義;張謙;趙俊喜;;中風膏抗腦缺血再灌注損傷的實驗研究[J];中國中醫(yī)藥科技;2014年03期

8 劉玥;張寅;張允嶺;;化痰通腑法治療缺血性中風急性期的Meta分析[J];中華中醫(yī)藥雜志;2014年05期

9 龔文勝;;血清TNF-α、IL-6在急性腦梗死病情及進展風險評估中的預測價值[J];中國實用醫(yī)藥;2014年02期

10 趙婷秀;高杉;李琳;劉素香;于春泉;李先濤;;中風病痰熱腑實證候臨床與實驗研究進展[J];天津中醫(yī)藥;2013年11期

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1 程發(fā)峰;精制清開靈注射液對腦缺血的治療作用及對興奮性毒性級聯損傷的調控機制[D];北京中醫(yī)藥大學;2011年

2 唐璐;從HPA軸水平初步探討缺血性中風急性期補腎護腦法的生物學基礎[D];北京中醫(yī)藥大學;2011年

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1 張波;米諾環(huán)素調控小膠質細胞表型對大鼠缺血性腦卒中的保護效應及機制研究[D];第三軍醫(yī)大學;2017年

2 高磊;李莉治療缺血性中風急性期學術思想總結及清火通絡湯治療缺血性中風的臨床研究[D];山東中醫(yī)藥大學;2015年

3 田華;國醫(yī)大師朱良春教授治療缺血性中風病的學術思想及臨證經驗[D];南京中醫(yī)藥大學;2015年

4 張紅;梔子苷衍生物的合成及抗炎免疫活性研究[D];安徽醫(yī)科大學;2013年

本文編號：2863549