缺血性中風(fēng)是因栓塞或者血栓引起的大腦中血管阻塞。缺血性中風(fēng)發(fā)生后的炎癥反應(yīng)會(huì)加重繼發(fā)的神經(jīng)元損傷,不利于大腦功能的恢復(fù)。小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中的常駐免疫效應(yīng)細(xì)胞,在生理情況下持續(xù)監(jiān)測(cè)大腦中的微環(huán)境。一旦局部缺血發(fā)生以后,小膠質(zhì)細(xì)胞被迅速激活,激活后的小膠質(zhì)細(xì)胞按照分泌因子和表面標(biāo)記物的不同被定義為激活型小膠質(zhì)細(xì)胞(M1型)和選擇性激活型小膠質(zhì)細(xì)胞(M2型),其中M1型小膠質(zhì)細(xì)胞主要發(fā)揮促炎和神經(jīng)毒性作用,M2型小膠質(zhì)細(xì)胞主要發(fā)揮抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用。小膠質(zhì)細(xì)胞參與腦缺血后炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸,其表型轉(zhuǎn)換與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。目前,清開靈注射液在缺血性中風(fēng)后抗炎作用的潛在機(jī)制尚未被徹底闡明。本課題基于小膠質(zhì)細(xì)胞表型變化探究清開靈注射液對(duì)腦缺血大鼠的抗炎作用機(jī)制,為研究中藥制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目的(1)證明清開靈注射液對(duì)MCAO大鼠的腦保護(hù)作用及抗炎作用。(2)基于小膠質(zhì)細(xì)胞表型變化探究清開靈注射液對(duì)MCAO大鼠的抗炎作用機(jī)制。方法(1)健康雄性清潔級(jí)Sprague-Dawley大鼠,體重210-230g,隨機(jī)分為三組,分別為:假手術(shù)組、模型組(0.9ml/100g)、清開靈組(0.9ml/100g)。模型組和清開靈組用線栓法制備大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型,假手術(shù)組暴露并分離血管,但不插入線栓。清開靈組在MCAO同時(shí)腹腔注射用2倍生理鹽水稀釋后的清開靈注射液,缺血后4小時(shí)第二次給藥。從第二天開始,每天給藥2次,中間間隔12小時(shí)。假手術(shù)組和模型組腹腔注射等體積的生理鹽水。在MCAO后24小時(shí)采用Bederson神經(jīng)功能評(píng)分評(píng)定大鼠神經(jīng)功能缺損情況,用TTC染色法測(cè)定大鼠腦梗死體積,用HE染色法觀察大鼠大腦缺血灶周圍組織病理形態(tài)變化。通過酶聯(lián)免疫吸附法(Elisa)檢測(cè)大鼠腦組織中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平,用Western blot法檢測(cè)NF-κB通路p-p65/p65和p-IkBa的變化,觀察缺血性中風(fēng)后清開靈注射液對(duì)NF-κB信號(hào)通路的作用以及對(duì)促炎細(xì)胞因子的影響。(2)健康雄性清潔級(jí)Sprague-Dawley大鼠,體重210-230g,隨機(jī)分為三組,分別為:假手術(shù)組、模型組(0.9ml/100g)、清開靈組(0.9ml/100g)。模型組和清開靈組制備MCAO模型,假手術(shù)組暴露并分離血管,但不插入線栓。清開靈組在MCAO同時(shí)腹腔注射用2倍生理鹽水稀釋的清開靈注射液,缺血后4小時(shí)第二次給藥,從第二天起每天給藥2次,中間間隔12小時(shí)。假手術(shù)組和模型組腹腔注射等體積的生理鹽水。在MCAO后24小時(shí)通過雙重免疫熒光染色法觀察M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD16和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD206的表達(dá)。利用Q-PCR進(jìn)一步檢測(cè)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白CD16、CD32、iNOS以及M2型小膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白CD206、TGF-β的mRNA的表達(dá),通過觀察小膠質(zhì)細(xì)胞表型變化探究清開靈注射液對(duì)腦缺血大鼠的抗炎作用機(jī)制。結(jié)果(1)神經(jīng)功能評(píng)分:假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能損傷,模型組和清開靈組大部分大鼠出現(xiàn)左側(cè)偏癱,身體向左側(cè)打轉(zhuǎn),懸尾時(shí)左側(cè)前肢不能完全伸直,內(nèi)收并貼近胸壁。與假手術(shù)組相比,模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高(P0.01);給予清開靈注射液治療后,與模型組相比,大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低(P0.01),神經(jīng)功能有一定程度的恢復(fù)。(2)TTC染色:假手術(shù)組大鼠腦組織呈現(xiàn)均勻的玫瑰紅色;與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦組織呈現(xiàn)明顯的白色缺血灶(P0.01);給予清開靈注射液治療后,與模型組相比,清開靈組大鼠的腦梗死體積顯著減小(P0.01)。(3)HE染色:假手術(shù)組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)完整,神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊有序,胞漿豐富,淡染,胞核大,核仁清晰。膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,排列整齊。模型組大鼠腦組織可見大片梗死灶,神經(jīng)細(xì)胞大片消失,數(shù)量減少,排列紊亂,梗死灶周圍膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生,壞死邊緣狹窄,中性粒細(xì)胞大量浸潤(rùn)。清開靈組大鼠腦梗死區(qū)面積顯著減少,神經(jīng)元數(shù)目減少程度低,輕度變性,膠質(zhì)細(xì)胞增生不明顯,邊緣區(qū)增寬。(4)對(duì)NF-κB通路以及促炎因子的影響:大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞后,與假手術(shù)組相比,模型組促炎因子TNF-α(P0.01)、IL-1β(P0.01)、IL-6(P0.01)的表達(dá)明顯升高;給藥后,與模型組相比,清開靈注射液可以抑制三種促炎因子TNF-α(P0.01)、IL-1β(P0.05)、IL-6(P0.05)的表達(dá),此外清開靈注射液降低了p-p65/p65的比值(P0.05),抑制了p-IkBa(P0.05)的表達(dá)。證明清開靈注射液能夠抑制NF-κB通路的激活,抑制促炎因子的分泌,抗缺血后炎癥。(5)雙重免疫熒光染色及Q-PCR:雙重免疫熒光染色結(jié)果顯示清開靈注射液抑制MCAO后M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物CD16(P0.01)的表達(dá),升高M(jìn)2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD206(P0.01)的表達(dá)。Q-PCR結(jié)果顯示清開靈注射液能夠降低M1型小膠質(zhì)細(xì)胞蛋白標(biāo)記物CD16、CD32、iNOS的mRNA表達(dá),升高M(jìn)2型小膠質(zhì)細(xì)胞蛋白標(biāo)記物CD206、TGF-β的mRNA表達(dá)。結(jié)論(1)清開靈注射液可以減少M(fèi)CAO大鼠腦梗死體積,降低大鼠神經(jīng)功能評(píng)分,改善大鼠腦組織的病理?yè)p害,清開靈注射液能夠抑制NF-κB通路的激活,減少促炎細(xì)胞因子的分泌,抑制缺血再灌注損傷大鼠的炎癥反應(yīng),發(fā)揮腦保護(hù)作用。(2)清開靈注射液可以抑制M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD16的表達(dá),促進(jìn)M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD206的表達(dá),降低M1型小膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白CD16、CD32、iNOS的mRNA的表達(dá),上調(diào)M2型小膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白CD206、TGF-β的mRNA的表達(dá),促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向有益的表型M2型轉(zhuǎn)換。清開靈注射液能夠通過調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞表型發(fā)揮抗炎作用。其對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞表型的調(diào)控可能與抑制NF-κB通路激活,降低促炎因子分泌有關(guān)。
【學(xué)位單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分

經(jīng)過TTC染色,腦梗死區(qū)呈現(xiàn)白色,正常組織被染成玫瑰紅色。從圖1-2可以看到模型組出現(xiàn)明顯的梗死灶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與空白組相比,模型組大鼠腦組織出現(xiàn)明顯的缺血灶(P<0.01);與模型組相比,清開靈組能明顯減少腦梗死體積(P<0.01)。結(jié)果見表2,圖2和圖3。圖3 各組大鼠腦梗死體積(%)

各組大鼠腦梗死體積(%)
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2863549