第一部分胡桃醌對惡性黑色素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[實驗?zāi)康腯探究胡桃醌(Juglone,Jug)對惡性黑色素瘤細(xì)胞系的生物學(xué)行為的影響及相關(guān)機制的初步探究。[實驗方法]采用噻唑藍(lán)(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide,MTT)法檢測Jug對A375、A2058惡黑細(xì)胞的生長抑制率并計算IC50值。流式細(xì)胞儀檢測Jug對惡黑細(xì)胞的周期及凋亡影響。蛋白免疫印跡法(Weastem blot,WB)檢測Jug對惡黑細(xì)胞干預(yù)后凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2及周期相關(guān)蛋白CyclinDl表達的影響。劃痕實驗和Transwell小室實驗檢測Jug對黑色素瘤細(xì)胞侵襲及遷移的影響。[實驗結(jié)果與結(jié)論]Jug對A375、A2058惡黑存在明顯抑制增殖作用,且存在明顯的時間及濃度依賴,24h IC50值分別為:3.31μg/mL、2.81μg/mL;48h IC50值為:2.33μg/mL、2.16μg/mL。Jug可以通過增加促凋亡蛋白Bax表達及減少抗凋亡蛋白Bcl-2表達誘導(dǎo)A375、A2058惡黑細(xì)胞凋亡。Jug可以通過影響周期相關(guān)蛋白CyclinD1的表達將A375、A2058惡黑細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。Jug可以明顯降低A375、A2058惡黑細(xì)胞侵襲及遷移能力。第二部分胡桃醌-PLGA納米粒制備及抑瘤作用評價[實驗?zāi)康腯制備胡桃醌-聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)納米粒,考察其理化性質(zhì)。評價其對惡性黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375及裸鼠皮下的抑瘤作用及相關(guān)安全性考察。[實驗方法]采用乳化揮發(fā)法制備Jug-PLGA-NPs,對其粒徑、包封率、載藥率以及體外釋放特征進行考察。熒光顯微鏡觀察PLGA-NPs在體外細(xì)胞的攝取情況,小動物活體成像儀觀測PLGA-NPs在BALB/c荷瘤裸鼠尾靜脈注射后體內(nèi)的分布。用MTT法比較Jug-PLGA-NPs與Jug對A375惡黑細(xì)胞增殖抑制作用,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。構(gòu)建A375裸鼠皮下瘤模型,評價Jug及Jug-PLGA-NPs的抑瘤作用,處死后對內(nèi)臟組織進行組織形態(tài)觀察,對腫瘤組織行CyclinD1蛋白免疫組化檢測并分析。[實驗結(jié)果與結(jié)論]制備的Jug-PLGA-NPs平均粒徑為149.6nm,包封率為68.39%,載藥率5.07%,具有良好的緩釋特征。PLGA-NPs在體外細(xì)胞攝取和體內(nèi)活體成像中具有良好的穿透和靶向性能。不同濃度Jug-PLGA-NPs均能明顯抑制A375細(xì)胞增殖、促進細(xì)胞凋亡,且呈明顯時間濃度依賴(P0.05),且48h時略優(yōu)于等濃度Jug。動物實驗中Jug與Jug-PLGA-NPs均展現(xiàn)出良好的抑瘤效果,而納米粒組抑瘤作用更好且小鼠耐受性更佳。結(jié)論:負(fù)載Jug的PLGA納米微粒制備簡便,具有良好的藥物緩釋、腫瘤靶向及體內(nèi)外抗腫瘤能力,且生物安全性尚可,為未來Jug的臨床應(yīng)用提供了一種新的藥物劑型。
【學(xué)位單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R283.6;R285
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
引言
    一、惡性黑色素瘤的治療藥物現(xiàn)狀
    二、中醫(yī)藥對惡性黑色素瘤的認(rèn)識與治療研究
    三、中藥青龍衣及其主要成分胡桃醌抗腫瘤作用研究
第一部分 胡桃醌對惡性黑色素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為影響
    一、胡桃醌對惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響
        1.1 實驗材料
            1.1.1 細(xì)胞株
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 主要儀器及實驗器材
        1.2 實驗方法
            1.2.1 藥物配置及分組
            1.2.2 MTT比色法檢測細(xì)胞增殖
            1.2.3 DAPI染色觀察藥物對細(xì)胞凋亡影響
            1.2.3 Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡
            1.2.4 PI單染法檢測細(xì)胞周期
            1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達
        1.3 統(tǒng)計方法
        1.4 實驗結(jié)果
            1.4.1 胡桃醌對惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖影響
            1.4.2 胡桃醌對惡性黑色素瘤細(xì)胞凋亡影響
            1.4.3 胡桃醌對惡性黑色素瘤細(xì)胞周期影響
    二、胡桃醌對惡性黑色素瘤細(xì)胞侵襲、遷移的影響
        2.1 實驗材料
            2.1.1 細(xì)胞株
            2.1.2 主要試劑
            2.1.3 主要儀器及實驗器材
        2.2 實驗方法
            2.2.1 0.1%結(jié)晶紫染液配制
            2.2.2 劃痕實驗檢測胡桃醌對惡黑細(xì)胞遷移影響
            2.2.3 Transwell實驗（不含基質(zhì)膠）檢測胡桃醌對惡黑細(xì)胞遷移影響
            2.2.4 Transwell實驗（含基質(zhì)膠）檢測胡桃醌對惡黑細(xì)胞侵襲影響
        2.3 統(tǒng)計方法
        2.4 實驗結(jié)果
            2.4.1 胡桃醌對惡黑細(xì)胞侵襲及遷移的影響
    三、討論
    四、結(jié)論
第二部分 胡桃醌-PLGA納米粒制備及抑瘤作用評價
    一、胡桃醌-PLGA納米粒子制備
        1.1 實驗材料
            1.1.1 細(xì)胞株及實驗動物
            1.1.2 實驗試劑
            1.1.3 主要儀器及實驗器材
        1.2 實驗方法
            1.2.1 納米粒子制備
            1.2.2 納米粒子的粒徑分布及電鏡形態(tài)
            1.2.3 胡桃醌濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
            1.2.4 Jug-PLGA-NPs的包封率及載藥量測定
            1.2.5 Jug-PLGA-NPs粒徑穩(wěn)定性檢測
            1.2.6 Jug-PLGA-NPs的體外釋放實驗
        1.3 統(tǒng)計方法
        1.4 實驗結(jié)果
            1.4.1 各處方制備Jug-PLGA-NPs外觀
            1.4.2 各處方制備納米粒子粒徑、包封率及載藥量
            1.4.3 納米粒的表征
            1.4.4 納米粒子的穩(wěn)定性及體外釋放
    二、胡桃醌-PLGA納米粒體外對A375細(xì)胞增殖影響及體內(nèi)外靶向性驗證
        2.1 實驗材料
            2.1.1 實驗細(xì)胞及動物
            2.1.2 主要試劑
            2.1.3 主要儀器及實驗器材
        2.2 實驗方法
            2.2.1     MTT比色法檢測細(xì)胞増殖影響
            2.2.2     Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡
            2.2.3 Jug-PLGA-NPs的體外細(xì)胞攝取
            2.2.4 荷瘤裸鼠活體成像
        2.3 統(tǒng)計方法
        2.4 實驗結(jié)果
            2.4.1 胡桃醌裸藥及納米粒對A375惡黑細(xì)胞增殖影響比較
            2.4.2 胡桃醌裸藥及納米粒對A375惡黑細(xì)胞促凋亡作用比較
            2.4.3 PLGA納米粒子的體外攝取及體內(nèi)靶向情況
    三、胡桃醌-PLGA納米粒對A375細(xì)胞體內(nèi)抑瘤作用評價
        3.1 實驗材料
            3.1.1 實驗細(xì)胞及實驗動物
            3.1.2 主要試劑
            3.1.3 主要儀器及實驗器材
        3.2 實驗方法及流程
            3.2.1 荷A375惡黑細(xì)胞皮下瘤動物模型造模
            3.2.2 實驗分組及給藥方式及劑量
            3.2.3 動物實驗觀測指標(biāo)及處理流程
            3.2.4 腫瘤組織CyclinD1免疫組化
            3.2.5 實驗動物內(nèi)臟HE染色
        3.3 統(tǒng)計方法
        3.4 實驗結(jié)果
            3.4.1 胡桃醌裸藥及納米粒體內(nèi)抑瘤作用比較
            3.4.2 藥物體內(nèi)毒性分析
    四、討論
    五、結(jié)論
參考文獻
附錄: （中英文縮略詞對照）
攻讀碩士期間取得的學(xué)術(shù)成果
致謝

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本文編號：2860054