目的:青錢柳為胡桃科青錢柳屬青錢柳種植物(拉丁名:Cyclocarya palaurus.(Batal.)Ijinskaja),已有研究報道青錢柳葉具有調(diào)節(jié)血糖、降血脂、抗氧化等多種保健功效�！吨袊兴庂Y源志要》中記載,青錢柳葉具清熱消渴解毒之效,對糖尿病有一定的療效,但目前青錢柳的降糖物質(zhì)基礎(chǔ)還缺乏深入系統(tǒng)的研究,不利于青錢柳的進(jìn)一步開發(fā)與利用。鑒于此,本課題從整體動物、體外模型、化學(xué)成分三個方面,開展青錢柳對Ⅱ型糖尿病大鼠的體內(nèi)外保護(hù)作用機制及其化學(xué)成分研究,從而闡明青錢柳活性部位改善Ⅱ型糖尿病的作用機制,明確青錢柳的降糖活性成分,為以后青錢柳的降糖物質(zhì)基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。方法:1、青錢柳對Ⅱ型糖尿病大鼠降糖作用的機制研究采用高脂飼料喂養(yǎng),結(jié)合腹腔注射低劑量STZ的方法誘發(fā)Ⅱ型糖尿病大鼠模型的發(fā)生。分別給予二甲雙胍馬來酸羅格列酮陽性藥(200mg/kg),低劑量(1.5g/kg)、中劑量(3g/kg)、高劑量(6g/kg)貴州產(chǎn)青錢柳水提液進(jìn)行干預(yù)治療,持續(xù)定時給藥12w。在給藥2、4、8、12w后,分別取尾靜脈血測定各組大鼠的空腹血糖值。給藥12w后,檢測各組大鼠末次空腹血糖值及葡萄糖耐量,并檢測大鼠血清中GSP、TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。包埋切片各組大鼠的胰腺組織和肝臟組織并進(jìn)行HE染色等處理,鏡檢并分析組織病理形態(tài)。2、青錢柳化學(xué)成分的研究以原兒茶酸、異槲皮苷、槲皮素、山奈酚、齊墩果酸、熊果酸為青錢柳的質(zhì)量評價的指標(biāo)性成分。采用Thermo Syncronis C_(18)柱(5μm,250mm×4.6mm),流動相為甲醇(A)-0.1%磷酸水(B),進(jìn)行梯度洗脫;流速1mL/min,柱溫30℃;檢測波長分別為260nm、360 nm、210nm等色譜條件,建立HPLC波長切換法對不同青錢柳中上述成分進(jìn)行分析,同時采用比色法對其總多糖進(jìn)行定量測定,以判斷貴州產(chǎn)青錢柳的質(zhì)量。采用大孔吸附樹脂柱色譜法分離青錢柳各極性洗脫部位,運用HPLC法明確各部位的分離情況,并用紫外分光光度法測定各洗脫部位的總黃酮和總皂苷含量。將進(jìn)一步分離出的不同洗脫部位進(jìn)行體外α-葡萄糖苷酶抑制作用研究,以篩選降糖活性部位。3、青錢柳降糖活性部位的質(zhì)譜分析研究為了明確青錢柳降糖活性部位的化學(xué)成分,研究運用四極桿-靜電場軌道阱串聯(lián)質(zhì)譜法(Q Exactive Orbitrap LC-MS/MS),采用色譜柱Thermo Accucore C_(18)柱(2.6μm,100mm×2.1mm);流動相乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)進(jìn)行梯度洗脫;流速為0.3mL/min,柱溫35℃;質(zhì)譜離子源為ESI源,檢測模式為正模式和負(fù)模式;掃描模式為Full MS/dd-MS2,掃描范圍m/z 200~1600,MS/MS模式時碰撞能為NCE 20eV、40eV和60eV等條件,對青錢柳經(jīng)體外篩選降糖作用較優(yōu)的乙酸乙酯部位60%乙醇洗脫液的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析。通過對各個色譜峰的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行解析,對比已知化合物的裂解規(guī)律,綜合保留時間、MS數(shù)據(jù)及參考文獻(xiàn)報道數(shù)據(jù)對各個色譜峰進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。同時運用氣相色譜-質(zhì)譜法(Gas Chromatography-Mass Spectrometer,GC-MS),條件采用5HP石英毛細(xì)管柱(30m×0.25mm,0.2μm),載氣流量為0.9mL/min,氣化室溫度280℃,進(jìn)行梯度升溫;質(zhì)譜離子源為EI,離子源溫度250℃;電子能量70eV,掃描范圍30~600m/z等條件,對在體外有一定降糖作用的青錢柳石油醚部位進(jìn)行定性分析,通過NIST標(biāo)準(zhǔn)庫對各個色譜峰的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比對解析。結(jié)果表明:1、貴州產(chǎn)青錢柳水提液有顯著的降糖作用,能明顯降低Ⅱ型糖尿病大鼠的空腹血糖,并增強其對葡萄糖的耐受能力,降低血液GSP和TC、TG、HDL-C、LDL-C的水平。HE染色切片顯示青錢柳干預(yù)組胰島細(xì)胞和肝細(xì)胞較正常,肝索結(jié)構(gòu)得到修復(fù),證明青錢柳能抑制胰島細(xì)胞萎縮,改善胰島的損傷,降低肝細(xì)胞內(nèi)脂肪的含量,改善肝的損傷。故推斷貴州產(chǎn)青錢柳的降糖作用機制主要可能有:修復(fù)受損的胰島β細(xì)胞和肝組織,促進(jìn)胰島素分泌同時避免胰島功能進(jìn)一步受損;改善機體脂代謝紊亂,抑制因糖化血清蛋白產(chǎn)生所導(dǎo)致的蛋白非功能化的惡性循環(huán)。2、建立了青錢柳化合物的HPLC定性和定量方法,絕大數(shù)青錢柳樣品中含有槲皮素和山奈酚,而多糖為青錢柳水提物中主要成分,三者可作青錢柳的指標(biāo)性成分。貴州產(chǎn)青錢柳中槲皮素(0.1232mg/g)、山奈酚(0.0883mg/g)和總多糖(70.11mg/g)的含量較于其它實驗樣品高,屬于質(zhì)量較好。經(jīng)紫外分光光度法對青錢柳的各分離部位進(jìn)行分析,乙酸乙酯部位60%乙醇洗脫液的總黃酮和總皂苷含量很高分別為0.1118mg/mL和4.401mg/mL。進(jìn)一步的體外α-葡萄糖苷酶抑制實驗發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位60%乙醇洗脫液的抑制效果最佳,IC_(50)為20.40mg/mL。3、經(jīng)LC-MS/MS分析降糖活性成分聚集的乙酸乙酯部位60%乙醇洗脫液可能含有3個黃酮苷和19個三萜皂苷,如Rhamnazin、Kaempferitrin、cyclocarioside C、cyclocariosideⅡ、secodammara-25,26-dien-3-oic acid-24-O-D-xylopyranoside等化合物可能是青錢柳的主要降糖物質(zhì)。經(jīng)GC-MS分析發(fā)現(xiàn)有一定降糖活性的青錢柳石油醚部以丁香酚和植物醇為主,還含有β-石竹烯、乙酸丁香酚酯、亞麻酸甲酯、新植二烯、鯊烯、β-欖香烯、α-姜黃烯等。青錢柳揮發(fā)部位以β-紫羅酮和β-谷甾醇為主。丁香酚、植物醇、β-紫羅酮及β-谷甾醇亦可作為青錢柳的活性成分。初步明確貴州產(chǎn)青錢柳降糖作用的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5;R284
【部分圖文】：

D E F圖 6 青錢柳水提液對Ⅱ型糖尿病大鼠胰腺組織的影響（HE，×200）A.正常對照組 B.模型組 C.陽性組 D.青錢柳低劑量組 E.青錢柳中劑量組 F.青錢柳高劑量組2.3.7 青錢柳對Ⅱ型糖尿病大鼠肝臟組織病理學(xué)的影響結(jié)果如圖 7 所示，正常對照組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核居于細(xì)胞中心，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞呈放射性規(guī)則排列，其內(nèi)無多余脂肪滴集群，模型組大鼠肝小葉界限模糊，其細(xì)胞索散亂分布，大部分干細(xì)胞尤其在小葉中央靜脈局部細(xì)胞出現(xiàn)較多的脂肪變性，視野下的胞漿內(nèi)出現(xiàn)數(shù)量和大小不一的脂滴空泡[77]。陽性藥組大鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)部分變形，其細(xì)胞索散亂分布和脂肪性病變[78]。與模型組相比，青錢柳低、中、高劑量組能不同程度上改善大鼠肝臟病理病變，特別是青錢柳高劑量組可明顯改善大鼠肝細(xì)胞損傷，肝細(xì)胞排列比較規(guī)則，無過多的脂肪聚集。說明青錢柳可降低細(xì)胞內(nèi)脂肪含量，改善脂代謝紊亂，有一定的保肝作用。

D E F圖 7 青錢柳水提液對Ⅱ型糖尿病大鼠肝形態(tài)的影響（HE，×200）A.正常對照組 B.模型組 C.陽性組 D.青錢柳低劑量組 E.青錢柳中劑量組 F.青錢柳高劑量組2.4 小結(jié)實驗主要研究青錢柳水提液中有效成分對糖尿病合并高血脂模型大鼠血糖、血脂含量的影響，選取大鼠體重、糖耐量、糖化血清蛋白作為血糖檢測指標(biāo)[78]。貴州產(chǎn)青錢柳水提液能明顯降低Ⅱ型糖尿病大鼠的空腹血糖，并增強其對葡萄糖的耐受能力，結(jié)合對大鼠胰島的病理切片觀察，青錢柳能抑制胰島細(xì)胞萎縮，改善胰島的損傷，推斷青錢柳的主要降糖機制可能是其所含成分能修復(fù)受損的胰島 β 細(xì)胞，避免胰島 β 細(xì)胞進(jìn)一步損傷，并促使胰島分泌胰島素以達(dá)到降糖效果。青錢柳各組 GSP 均比陽性組低，說明青錢柳具有抑制因糖和蛋白質(zhì)的非酶促反應(yīng)導(dǎo)致蛋白質(zhì)非功能化，所產(chǎn)生的糖化血清蛋白又加速這一進(jìn)程發(fā)生的惡性循環(huán)，從而緩解Ⅱ型糖尿病癥狀的作用。臨床上認(rèn)為，過高的 TC、TG 和 LDL-C 會

26圖 8 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液與青錢柳乙酸乙酯部位 95%乙醇洗脫液于200nm-600nm 波長掃描的吸收光譜圖 青錢柳各洗脫部位總皂苷的含量測定試劑制備5%香草醛冰乙酸溶液：稱取香草醛 0.5g，加入冰乙酸溶解并定容至 10。人參皂苷 Re 標(biāo)準(zhǔn)液：精密稱取人參皂苷 Re 對照品 2.0mg，加甲醇定L，得濃度為 0.2mg/mL 的人參皂苷 Re 標(biāo)準(zhǔn)液。樣品測定分別吸取乙酸乙酯部位 60%乙醇洗脫液 50μl、乙酸乙酯部位 95%乙醇洗l 和其它各洗脫部位 1.0mL 于蒸發(fā)皿中，60℃水浴揮干溶劑，冷卻至室溫 5%香草醛冰乙酸溶液 0.2mL 復(fù)溶殘渣，再加高氯酸 0.8mL，混勻后移入
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本文編號：2846968