中藥及其復方是中華民族的瑰寶,是我國研發(fā)自主創(chuàng)新性新藥的重要源泉�；诂F(xiàn)代生命科學基礎研究成果和先進分析技術,詮釋中藥物質基礎和作用機制,特別是藥效物質基礎和活性作用機制研究有了長足的進步。中藥“痹祺膠囊”系漢朝名醫(yī)華佗的傳世驗方,主要用于治療風濕、類風濕關節(jié)炎、肩周炎、頸椎病等屬于中藥“痹癥”類疾病,在臨床上應用廣泛,療效確切。但由于有馬錢子入藥,其安全性一直受到臨床大夫和監(jiān)管部門的關注。本論文配合安全性評價,開展了伴隨毒代動力學研究,揭示了痹祺膠囊有效成分同時也是毒性成分的馬錢子堿和士的寧在大鼠血漿中的藥代動力學特點,闡明其暴露量與劑量的關系。利用現(xiàn)代分析技術對痹祺膠囊在大鼠體內主要暴露成分及其代謝產物進行了深入分析和鑒定,進而運用反向分子對接技術對痹祺膠囊在大鼠血中主要暴露成分及其代謝產物進行預測分析,探究可能的作用靶點以及作用途徑,為痹祺膠囊臨床合理用藥提供科學依據(jù)。首先建立測定大鼠血漿中馬錢子堿和士的寧含量的快速液相色譜-串聯(lián)質譜(RRLC-MS/MS)分析方法并進行全面驗證。方法驗證結果表明,該方法線性范圍寬(馬錢子堿0.025-25ng/mL,士的寧0.25-250ng/mL),線性良好(r0.999),最低定量限為馬錢子堿0.025ng/mL,士的寧0.25ng/mL。質控樣品日內、日間精密度RSD均小于14.2%,準確度在90.0-109%之間。馬錢子堿和士的寧的提取回收率分別為90.7-107%和95.9-103%,基質效應分別為94.7-104%和99.0-113%。長期穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性實驗均證明在實驗過程中血漿樣品能夠保持穩(wěn)定。方法驗證結果表明所建立分析方法符合生物樣品分析方法指導原則的要求,能夠滿足大鼠血漿中馬錢子堿和士的寧含量測定結果準確可靠的要求。采用所建立的方法測定伴隨毒代動力學研究采集的血漿樣本中馬錢子堿和士的寧的含量,計算獲得相關毒代動力學參數(shù)。動物實驗共設置3個痹祺膠囊給藥劑量組,給藥劑量分別為0.4g/kg,0.8g/kg和1.6g/kg,連續(xù)灌胃給藥3個月,每天給藥1次。毒理學實驗結果表明各個給藥劑量組均未見與藥品明確相關的毒性反應,未見明顯毒性反應劑量(NOAEL)為1.6g/kg。伴隨毒代動力學研究結果表明,馬錢子堿和士的寧在大鼠體內暴露量隨劑量的增加而增高,AUC、Cmax隨劑量的增加而顯著增大(P0.01),雌雄大鼠的毒代動力學特征不同,提示臨床上用藥劑量應該考慮性別差異;長期經口服給藥痹祺膠囊,馬錢子堿和士的寧在大鼠體內有蓄積傾向(蓄積因子RCmax在2.54-4.89之間),提示應合理控制臨床用藥劑量,制定合理給藥周期十分必要。然后運用高效液相-高分辨質譜聯(lián)用法(HPLC-LTQ/FTICRMS/MSn)分析了痹祺膠囊內容物以及大鼠灌胃給藥痹祺膠囊后尿液、糞便、膽汁、血漿樣本,采集了保留時間、一級高分辨質譜數(shù)據(jù)和多級質譜數(shù)據(jù)。采用適用于復雜生物樣本中代謝產物發(fā)現(xiàn)和鑒定的數(shù)據(jù)后處理技術質譜樹狀圖相似度過濾(MTSF)技術,對大鼠灌胃給藥痹祺膠囊后尿液、糞便、膽汁、血漿中的原型成分和代謝產物進行分析和鑒定。在痹祺膠囊內容物中檢測出23種主要化學成分,包括生物堿類成分7種,皂苷類成分5種,酚酸類成分2種,內酯類成分2種,甾酮類成分2種,菲醌類成分2種,黃酮類成分2種,糖類成分1種。在大鼠的尿液、糞便、膽汁、血漿樣品中共發(fā)現(xiàn)了痹祺膠囊的16個原型成分(生物堿類3種,皂苷類5種,內酯類2種,甾酮類2種,菲醌類2種,黃酮類1種,糖類1種)和56個代謝產物(生物堿類20種,皂苷類2種,內酯類22種,甾酮類2種,菲醌類1種,黃酮類9種),包括在大鼠尿液中發(fā)現(xiàn)了 8個原型成分和32個代謝產物,在糞便中發(fā)現(xiàn)了 12個原型成分和17個代謝產物,在膽汁中發(fā)現(xiàn)了 6個原型成分和17個代謝產物,在血漿中發(fā)現(xiàn)了 13個原型成分和8個代謝產物。針對痹祺膠囊在大鼠血中44種暴露成分(包括15種生物堿類成分,6種皂苷類成分,9種內酯類成分,2種甾酮類成分,3種菲醌類成分,8種黃酮類成分,1種糖類成分),利用PharmMapper數(shù)據(jù)庫,反向分子對接篩選其作用的潛在靶點,通過KEGG數(shù)據(jù)庫將獲取的潛在靶點映射在類風濕關節(jié)炎疾病相關通路中,確定作用靶標。最后采用Cytoscape軟件構建痹祺膠囊治療類風濕關節(jié)炎的“化合物-靶點-通路-疾病”網絡藥理圖。預測的結果表明,38個活性成分(包括15種生物堿類成分,6種皂苷類成分,4種內酯類成分,2種甾酮類成分,3種菲醌類成分,7種黃酮類成分,1種糖類成分)與31個靶點蛋白在6條類風濕關節(jié)炎疾病相關通路中起到至關重要的作用。君藥馬錢子含有最多的活性成分(15種),關聯(lián)到更多的靶點蛋白(28個)以及信號通路(6個),為中藥復方的多成分、多靶點、多途徑作用機制探索提供了可行的技術手段。
【學位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

Ｆｉｇｒｕｅ?２－２?ＴＩＣ?ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ?ｏｆ?ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ?ｅｆｆｅｃｔｓ?ｏｆ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｃｏｌｕｍｎｓ．??Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ?１－３?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ?ｈｕｐｅｒｚｉｎｅ?Ａ，?ｂｒｕｃｉｎｅ，?ｓｔｒｙｃｈｎｉｎｅ．??其次，如Ｆｉｇ．２－３所示，在分析方法中選用０．２％甲酸水溶液－乙腈體系作為流動??相，其中乙腈作為有機相，原因是乙腈相較于甲醇而言具有更大的洗脫強度，從而??可以減少色譜峰的展寬，得到良好的峰型。此外，使用乙腈進行洗脫，粘度較低，??可以減少系統(tǒng)壓力。在水相中加入０．２％甲酸，可以改善化合物的峰型，減少拖尾現(xiàn)??象，此外，還可以提高樣品在離子源中的離子化效率。??Ａ?Ｍｏｂｉｌｅ?ｐｈａｓｅ?Ａ?＝?ｗａｔｅｒ?２??Ｍｏｂｉｌｅ?ｐｈａｓｅ?Ｂ?＝?ｍｅｔｈａｎｏｌ?ｆ＼??ｉ?Ｇ?ｈ?Ｍｏｂｉｌｅ?ｐｈａｓｅ?Ａ?＝?ｗａｔｅｒ?２??Ｍｏｂｉｌｅ?ｐｈａｓｅ?Ｂ?＝?ａｃｃｔｏｎｉｔｒｉｌｃＡ??，，?上?／??

?第二章痹棋膠囊中馬錢子堿和士的寧在大鼠體內的伴隨毒代動力學研宄???最后，為消除共同洗脫出的內源性物質對目標化合物離子化過程產生的影響，??對洗脫梯度進行了如下的調整：０－５?ｍｉｎ，５－３０％?Ｂ；?５－７?ｍｉｎ，３０％?Ｂ調整為０－５?ｍｉｎ，??５－８％?Ｂ；?５－７?ｍｉｎ，８％?Ｂ，使得內源性化合物保留在柱子上，消除基質效應的影響（馬??錢子堿和士的寧的相對基質效應由７６．１－９１．０％改善為９４．７－１１３％）。然后，在下個分??析批開始前，加入清洗柱子的程序將內源性化合物洗脫下來，最終，每個樣品的分??析時間為１１?ｍｉｎ。??４．１．２內標的選擇??根據(jù)內標法定量中對內標化合物的相關要求，應充分考慮內標化合物和目標測??定化合物在化學結構、色譜行為、離子化程度是否存在相互抑制等諸多因素。通過??比較不同的生物堿類化合物（他克林，石杉堿甲以及烏頭堿），結果如Ｆｉｇ．２－４所示，??最終選擇石杉堿甲為內標。它的保留時間與目標測定化合物馬錢子堿和士的寧接近，??在ＥＳＩ正離子模式下有很好的電離，且不會被血漿基質中的干擾物質抑制。??

２０?２５?３０?３５?４０?４５?５０?５５?６０??Ｃｏｉｔｉｏｎ?Ｅｎｅｒｇｉｅｓ?（ｅ＇．７）??圖２－６?士的寧、馬錢子堿和石杉堿甲在不同ＣＥ電壓下的峰面積（ｎ＝３）??Ｆｉｇｕｒｅ?２－６?Ｔｈｅ?ｐｅａｋ?ａｒｅａ?ｏｆ?ｓｔｒｙｃｈｎｉｎｅ，?ｂｒｕｃｉｎｅ?ａｎｄ?ｈｕｐｅｒｚｉｎｅ?Ａ?ａｔ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ??ｅｎｅ
【參考文獻】

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本文編號：2843687