目的:通過解毒益智方的主藥黃連的提取物——黃連多糖對阿爾茨海默病線蟲模型的作用,觀察黃連多糖對線蟲模型神經(jīng)保護(hù)及Aβ肽聚集作用的影響,為解毒益智方在臨床治療AD提供有力的理論依據(jù)。方法:以課題組制備的解毒益智方凍干粉為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)原料提取黃連多糖,以超聲提取法、煮沸提取法和冷浸提取法對實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行黃連多糖的提取,考察最佳提取條件,獲得純度較高的黃連多糖提取物,進(jìn)而制備阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因線蟲模型,對實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ吞砑狱S連多糖提取物,其中對照組(含黃連多糖0mg/L)、低劑量組(含黃連多糖25mg/L)、中劑量組(含黃連多糖50mg/L)、高劑量組(含黃連多糖100mg/L),考察不同濃度的黃連多糖對線蟲壽命、神經(jīng)保護(hù)以及Aβ肽聚集作用的影響。結(jié)果:1.以解毒益智方為原料提取黃連多糖,確定超聲提取法提取黃連多糖的得率為39.4%,煮沸提取法提取黃連多糖的得率為42.7%,冷浸提取法提取黃連多糖的得率為22.8%。2.黃連多糖對線蟲壽命的影響實(shí)驗(yàn)表明,在2d時(shí),對照組平均存活率為22.2-28.6%,25mg/L實(shí)驗(yàn)組平均存活率為63.0-72.3%,50mg/L實(shí)驗(yàn)組平均存活率為48.9-62.5%,100mg/L實(shí)驗(yàn)組平均存活率為59.3-72.03%。在5d時(shí),對照組平均存活率僅為5.6-10.2%,25mg/L實(shí)驗(yàn)組平均存活率僅為13.0-29.8%,50mg/L實(shí)驗(yàn)組平均存活率僅為13.3-18.8%,100mg/L實(shí)驗(yàn)組平均存活率僅為26.0-28.8%,與25mg/L實(shí)驗(yàn)組線蟲壽命水平相近。3.以相同的實(shí)驗(yàn)分組及給藥濃度的條件下對線蟲模型進(jìn)行癱瘓率實(shí)驗(yàn),從線蟲接種至36h,線蟲未癱瘓率各實(shí)驗(yàn)組均高于90%,從36-60h,線蟲癱瘓率明顯增多,至實(shí)驗(yàn)60h時(shí),25mg/L組線蟲未癱瘓率為50.0%,50mg/L組線蟲未癱瘓率為56.7%,100mg/L組線蟲未癱瘓率為65.9%,從60-92h,受試線蟲癱瘓率下降更加明顯,至92h,各實(shí)驗(yàn)組線蟲基本完全癱瘓,但其中100mg/L實(shí)驗(yàn)組仍有6.7%的線蟲未發(fā)生癱瘓。4.不同濃度黃連多糖對線蟲模型Aβ肽聚集影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:對照組Aβ肽聚集非常緊密,周身可見染色的蛋白聚集團(tuán),25mg/L實(shí)驗(yàn)組可以看到零星的空洞,50mg/L實(shí)驗(yàn)組可見大塊兒熒光染色空洞,比低劑量組空洞明顯增多、增大,100mg/L實(shí)驗(yàn)組熒光染色空洞現(xiàn)象更加明顯,且部分線蟲頭部幾乎不可見熒光染色。裂解線蟲后染色測定裂解液熒光強(qiáng)度,顯示對照組的熒光強(qiáng)度為0.74±0.08,25mg/L實(shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度為0.71±0.06,50mg/L實(shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度為0.58±0.07,100mg/L實(shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度為0.49±0.05,隨著藥物濃度的增加,熒光強(qiáng)度逐漸降低。結(jié)論:1.黃連多糖以煮沸法提取能夠獲得更大的得率,最佳提取條件為料液比為1:3,提取溫度為100℃,提取時(shí)間為20min,提取次數(shù)為5次。2.黃連多糖對線蟲模型壽命的延長具有明顯效果,25-100mg/L藥物濃度對線蟲壽命的影響沒有太大差異。3.黃連多糖實(shí)驗(yàn)組對線蟲的神經(jīng)保護(hù)作用明顯,神經(jīng)保護(hù)的能力在25-100mg/L區(qū)間內(nèi)隨著藥物濃度的增加而提高。4.25-100mg/L的黃連多糖對AD線蟲模型Aβ肽聚集具有顯著抑制作用,在實(shí)驗(yàn)濃度區(qū)間隨藥物濃度的增加,抑制作用與濃度呈正相關(guān)。
【學(xué)位單位】：長春中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

圖 1 不同濃度黃連多糖對線蟲壽命的影響（與對照組相比，*p<0.05）（第一次實(shí)驗(yàn)）圖 2 不同濃度黃連多糖對線蟲壽命的影響（與對照組相比，*p<0.05）（第二次實(shí)驗(yàn)）本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步減少實(shí)驗(yàn)誤差，該實(shí)驗(yàn)在第一次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后再次重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)。在統(tǒng)

18圖 2 不同濃度黃連多糖對線蟲壽命的影響（與對照組相比，*p<0.05）（第二次實(shí)驗(yàn)）本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步減少實(shí)驗(yàn)誤差，該實(shí)驗(yàn)在第一次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后再次重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)。在統(tǒng)不同給藥濃度對線蟲壽命影響的同時(shí)對比分析兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異。從圖中可以看出：次實(shí)驗(yàn)中線蟲壽命變化趨勢相近，說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為穩(wěn)定，對照組在 2d 時(shí)，平均存活率 22.2-28.6%，5d 時(shí)，平均存活率僅為 5.6-10.2%，隨著時(shí)間的推移，線蟲死亡數(shù)量急劇加，相比實(shí)驗(yàn)組而言，線蟲存活率明顯偏低，而 25mg/L 實(shí)驗(yàn)組，在 2d 時(shí)，平均存活率 63.0-72.3%，5d 時(shí)，平均存活率僅為 13.0-29.8%；50mg/L 實(shí)驗(yàn)組，在 2d 時(shí)，平均存活

率為 48.9-62.5%，5d 時(shí)，平均存活率僅為 13.3-18.8%，略低于 25mg/L 實(shí)驗(yàn)組，明顯高于對照組；100mg/L 實(shí)驗(yàn)組，在 2d 時(shí)，平均存活率為 59.3-72.03%，5d 時(shí)，平均存活率僅為26.0-28.8%，與 25mg/L 組線蟲壽命水平相近。由此可以確定，黃連多糖對線蟲模型的壽命具有明顯影響，對線蟲壽命的延長具有明顯效果，25-100mg/L 藥物濃度對線蟲壽命的影響沒有太大差異。6.3 黃連多糖對線蟲癱瘓率影響以阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因線蟲為實(shí)驗(yàn)對象，將實(shí)驗(yàn)組分為對照組（含黃連多糖 0mg/L）、低劑量組（含黃連多糖 25mg/L）、中劑量組（含黃連多糖 50mg/L）、高劑量組（含黃連多糖 100mg/L），隨機(jī)挑選同期化線蟲至個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)平板挑選 30-50 只線蟲，經(jīng)25℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，自接種后每 2h 觀察一次線蟲癱瘓情況，癱瘓線蟲為神經(jīng)損傷線蟲模型，對線蟲癱瘓情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見圖 3、4 所示：

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8 朱e

本文編號：2827807