瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)為瑞香科狼毒屬多年生草本植物,又名紅狼毒、斷腸草等,經(jīng)過干燥的根部為其入藥部位,其性味苦、平、辛、有毒,有逐水祛痰、破積殺蟲的功效。藥理學(xué)研究表明瑞香狼毒藥材中含量較高的黃酮類、香豆素類化合物有較好的生物活性。但目前關(guān)于瑞香狼毒的質(zhì)量控制中,沒有同時(shí)對(duì)黃酮類和香豆素類定量測定的方法。瑞香狼毒屬于大毒藥材,在用藥時(shí)易與大戟科狼毒大戟及月腺大戟混淆,為了用藥的準(zhǔn)確性,應(yīng)建立更全面的質(zhì)量控制方法,將其區(qū)分開。在現(xiàn)有的對(duì)瑞香狼毒指紋圖譜的研究中,選用的產(chǎn)地較單一,不能有很好的代表性。瑞香狼毒在民間應(yīng)用于治療腫瘤等,藥理學(xué)研究表明其醇提物、水提物及總黃酮等都具有廣泛的抗腫瘤活性,但具體作用的有效成分尚不明確。本課題對(duì)瑞香狼毒總黃酮抗腫瘤的關(guān)鍵成分進(jìn)行研究,提取純化瑞香狼毒總黃酮成分,建立其指紋圖譜,并將總黃酮作用于肺癌A549細(xì)胞,計(jì)算其IC50。運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)度分析法及多元線性回歸法建立總黃酮指紋圖譜與IC50之間的譜效關(guān)系,從而篩選出抗腫瘤的關(guān)鍵成分。1 UPLC法測定瑞香狼毒中傘形花內(nèi)酯和狼毒色原酮的含量色譜條件為BEH C18(2.1×100 mm,1.7μm)色譜柱;流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),進(jìn)行梯度洗脫;檢測波長傘形花內(nèi)酯:327 nm,狼毒色原酮:297 nm;流速0.3 mL·min-1;進(jìn)樣量2μL,柱溫25℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示傘形花內(nèi)酯、狼毒色原酮的線性范圍分別為0.74~17.64μg·mL-1(r=0.9999)、14.70~352.8μg·mL-1(r=0.9998),平均回收率分別為99.20%,99.63%,RSD分別為1.81%,1.65%。13批瑞香狼毒藥材中傘形花內(nèi)酯的含量范圍為:0~0.602 mg·g-1,狼毒色原酮的含量范圍6.08~33.37 mg·g-1。該方法操作簡便、快速、重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠,可用于中藥瑞香狼毒的質(zhì)量控制。2 HPLC法建立瑞香狼毒藥材的指紋圖譜色譜條件為Hypersil GOLDaQ-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色譜柱;流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1%磷酸(B),梯度洗脫:0~7 min,90%~80%B;7~17 min,80%~65%B;17~32 min,65%~60%B;32~42 min,60%~50%B;42~45 min,50%~40%B;45~55 min,40%B;檢測波長:290 nm;流速:1.0 mL·min-1;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:10μL。方法學(xué)驗(yàn)證表明精密度好,專屬性高。運(yùn)用相似度評(píng)價(jià)、聚類分析方法對(duì)藥材質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),確定了14個(gè)共有峰,不同產(chǎn)地間的相似度大都在0.9以上,說明不同產(chǎn)地間藥材的化學(xué)成分組成基本一致。3 UPLC法建立瑞香狼毒藥材的指紋圖譜色譜條件為Waters BEH C18(2.1×100 mm,1.7μm)色譜柱;流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1%磷酸(B),梯度洗脫:0~2 min,90%~80%B;2~3.5 min,80%~70%B;3.5~6.5 min,70%~60%B;6.5~8 min,60%~50%B;8~10 min,50%~40%B;10~15 min,40%B;檢測波長:290nm;流速:0.3 mL·min-1;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:2μL。方法學(xué)驗(yàn)證表明精密度好,專屬性高。運(yùn)用相似度評(píng)價(jià)、聚類分析對(duì)藥材質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),確定了16個(gè)共有峰,不同產(chǎn)地間的相似度大都在0.9以上,這與HPLC法建立的指紋圖譜結(jié)果相符合,且UPLC具有更好的分離效果。4 HPLC法建立瑞香狼毒總黃酮的指紋圖譜色譜條件為Hypersil GOLDaQ-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色譜柱;流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1%磷酸(B),梯度洗脫:0~10 min,80%~65%B;10~25 min,65%~60%B;25~45 min,60%~50%B;45~50min,50%B;檢測波長:297 nm;流速:1.0 mL·min-1;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:10μL。方法學(xué)驗(yàn)證表明精密度好,專屬性高。運(yùn)用相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng),確定了11個(gè)共有峰。5瑞香狼毒總黃酮對(duì)肺癌A549細(xì)胞的抑制作用采用MTT法測定瑞香狼毒總黃酮對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用,呈現(xiàn)時(shí)間和劑量的依賴性。48h的最高抑制率為81.76%.不同產(chǎn)地的瑞香狼毒總黃酮的抑制率不同。6瑞香狼毒總黃酮抗腫瘤譜效關(guān)系瑞香狼毒總黃酮指紋圖譜的11個(gè)共有峰與抗腫瘤的IC50的灰色關(guān)聯(lián)度排序?yàn)镻1、P7、P6、P2、P11、P10、P5、P8、P9、P4、P3,其中P2為傘形花內(nèi)酯,P7為狼毒色原酮。11個(gè)共有峰與抗腫瘤的IC50的多元線性回歸方法分析結(jié)果顯示P1、P4、P5、P7、P9、P10、P11和抗腫瘤效應(yīng)有關(guān),譜效方程為:Y=-0.591P1-2.044P4+0.442P5+0.372P7+2.969P9-0.996P10+0.560P11;P1、P4、P10與抑制A549細(xì)胞效應(yīng)呈負(fù)相關(guān),P5、P7、P9、P11與抑制A549細(xì)胞效應(yīng)呈正相關(guān)。綜上所述,本研究首次建立了UPLC法測定傘形花內(nèi)酯和狼毒色原酮的含量,比較了HPLC和UPLC法指紋圖譜的區(qū)別,且本研究的藥材較以往的研究,來源更為廣泛。采用譜效關(guān)系的方法確定了與瑞香狼毒抗腫瘤效應(yīng)有關(guān)的成分,為以后建立更具有針對(duì)性的質(zhì)量控制方法打下基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R284;R285

【參考文獻(xiàn)】

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1 樊佳新;王帥;孟憲生;包永睿;李天嬌;;基于微流控芯片技術(shù)的荊芥誘導(dǎo)肺腫瘤細(xì)胞凋亡譜效關(guān)系研究[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2017年01期

2 高雯;宋慧鵬;楊華;李萍;;在線二維液相色譜技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J];色譜;2017年01期

3 程銀平;林朝展;劉啟德;祝晨

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