背景:蛋白質(zhì)能量消耗(Protein-energy wasting,PEW)是慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease,CKD)的重要并發(fā)癥,和患者心血管事件發(fā)病率及死亡風(fēng)險密切相關(guān)。骨骼肌萎縮是診斷CKD-PEW最可靠的標(biāo)準(zhǔn)。CKD-PEW目前無特異性治療方法,腎衰營養(yǎng)膠囊對CKD-PEW患者療效顯著,但作用機制不明,很難為中藥的良好療效提供理論依據(jù)。PEW骨骼肌萎縮的主要病理機制包括泛素-蛋白酶體系統(tǒng)、caspase-3和肌抑素的激活。近年來,越來越多的證據(jù)表明,氧化應(yīng)激和自噬與CKD-PEW骨骼肌萎縮密切相關(guān)。活性氧(Reactive oxygen species,ROS)可以作為細(xì)胞信號分子啟動自噬體的形成,自噬則通過去除蛋白質(zhì)聚集物和受損的細(xì)胞器來減少氧化損傷,而過度自噬又進一步造成組織損傷。氧化應(yīng)激和自噬相互作用,可能是參與PEW骨骼肌萎縮的重要因素。課題組最近研究發(fā)現(xiàn),腎衰營養(yǎng)膠囊可以調(diào)節(jié)CKD大鼠氧化應(yīng)激和自噬狀態(tài),同時改變骨骼肌中p-Akt、p-mTOR、CREB等相關(guān)蛋白的表達水平。目前尚無基于氧化應(yīng)激和自噬探討中藥對PEW骨骼肌萎縮治療作用的相關(guān)報道。目的:以5/6腎切除模型大鼠和腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-alpha,TNF-α)誘導(dǎo)的C2C12骨骼肌細(xì)胞為研究對象,通過體內(nèi)和體外實驗明確腎衰營養(yǎng)膠囊對CKD-PEW骨骼肌萎縮的治療作用,探討其對氧化應(yīng)激和自噬的影響,并研究相關(guān)分子機制,闡明腎衰營養(yǎng)膠囊改善CKD-PEW骨骨骼肌萎縮的作用途徑。方法:通過5/6腎切除方法建立CKD大鼠模型,設(shè)置假手術(shù)組(Sham)、模型組(Model)、腎衰營養(yǎng)膠囊(SSYYJN)干預(yù)組和開同(KA)對照組。以血清肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、24h尿蛋白、炎癥因子等作為CKD的療效評價標(biāo)準(zhǔn),以血清白蛋白(Serum albumin,ALB)、體重、肌肉質(zhì)量、骨骼肌橫截面積等作為改善PEW和骨骼肌萎縮的評價指標(biāo),并通過檢測腎衰營養(yǎng)膠囊對TNF-α誘導(dǎo)的C2C12小鼠成肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響,明確腎衰營養(yǎng)膠囊對CKD-PEW骨骼肌萎縮的治療作用;以ROS活性、線粒體形態(tài)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)水平為標(biāo)準(zhǔn),檢測腎衰營養(yǎng)膠囊對CKD大鼠和TNF-α誘導(dǎo)的C2C12成肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響;通過電鏡檢測骨骼肌組織中自噬小體(autophagosomes,APs)、自噬溶酶體(autolysosome,ALs)數(shù)目,通過蛋白質(zhì)印跡法(Westernblotting,WB)檢測p62和LC3-Ⅱ蛋白的表達水平,探討腎衰營養(yǎng)膠囊對自噬的影響;最后通過檢測CKD大鼠骨骼肌和C2C12細(xì)胞中磷酸化磷酸肌醇3激酶(Phosphoinositide 3-kinase,p-PI3K)、p-Akt、p-mTOR、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)、自噬相關(guān)蛋白 7(autophagy related 7,Atg7)、自噬相關(guān)蛋白5(autophagy related 5,Atg5)等蛋白的表達,并通過在C2C12細(xì)胞系中構(gòu)建Nox2高表達穩(wěn)定株,反向驗證腎衰營養(yǎng)膠囊對氧化應(yīng)激和自噬的調(diào)節(jié)作用,闡明腎衰營養(yǎng)膠囊對CKD-PEW的作用機制。結(jié)果:體內(nèi)實驗表明腎衰營養(yǎng)膠囊干預(yù)后,CKD大鼠Scr、BUN、24h尿蛋白及炎癥因子水平較Model組顯著降低;大鼠體重、骨骼肌重量、ALB水平較Model組顯著增加,其治療效果和開同組無明顯差異;HE結(jié)果顯示,腎衰營養(yǎng)膠囊干預(yù)后,CKD大鼠的骨骼肌體積和橫截面積較Model組有所增加;體外實驗表明,腎衰營養(yǎng)膠囊含藥血清干預(yù)組可以減輕TNF-α誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞凋亡,促進C2C12細(xì)胞增殖。腎衰營養(yǎng)膠囊治療組線粒體損傷程度較Model組顯著減輕,CKD大鼠骨骼肌中Aps和ALs的數(shù)目均較Model組減少。同時,體內(nèi)體外實驗均表明,腎衰營養(yǎng)膠囊可以減少ROS含量,增強CKD狀態(tài)下SOD、GSH-Px、CAT活性,降低MDA水平,并且在減少LC3蛋白表達量的同時增強p62蛋白的表達。基于腎衰營養(yǎng)膠囊作用機制的研究表明:腎衰營養(yǎng)膠囊干預(yù)后,CKD大鼠骨骼肌組織和C2C12細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白水平較模型組升高,但自噬相關(guān)蛋白CREB、Atg5、Atg7表達水平較模型組降低;在高表達Nox2的C2C12成肌細(xì)胞穩(wěn)定株中,腎衰營養(yǎng)膠囊對p-PI3K、p-Akt、p-mTOR及自噬相關(guān)蛋白CREB、Atg5、Atg7的調(diào)節(jié)作用減弱。結(jié)論:腎衰營養(yǎng)膠囊通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR/CREB信號通路,減輕5/6腎切除模型大鼠和TNF-α誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞氧化應(yīng)激和自噬水平,改善CKD-PEW骨骼肌萎縮。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

鑒定為凋亡細(xì)胞，拍攝五個隨機顯微鏡視野，將凋亡細(xì)胞的百胞總數(shù)的比例量化為凋亡細(xì)胞。逡逑計分析逡逑組的數(shù)據(jù)分析采用ｔ檢驗，使用單因素方差分析法（ｏｎｅ－ｗａｙ邋ＡＮＯ四組數(shù)據(jù)進行分析。所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)均采用ＳＰＳＳ１３．０分析。數(shù)據(jù)表示，雙側(cè)檢驗Ｐ＜0．0５被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。逡逑果逡逑Ｉ）大鼠模型的制備：逡逑左側(cè)腎組織２／３切除術(shù)１周后，進行右腎切除，兩次手術(shù)共切除術(shù)４周后檢測動物一般指標(biāo)、血生化和２４ｈ尿蛋白，一般指少，體重減輕，反應(yīng)靈敏度下降；血生化提示Ｓｃｒ、ＢＵＮ明顯升高則提示造模成功。逡逑Ｉ逡逑

第一章：腎衰營養(yǎng)膠囊對ＣＫＤ骨骼肌萎縮的改善作用。逡逑、腎衰營養(yǎng)膠囊對ＣＫＤ大鼠腓腸肌體積的影響逡逑體視熒光顯微鏡下顯示，模型組大鼠的腓腸肌體積較假手術(shù)組顯著減少（邋０．００１）；腎衰營養(yǎng)膠囊和開同治療組的腓腸肌體積比ＣＫＤ模型組大鼠顯著口，向假手術(shù)組水平靠攏。腎衰營養(yǎng)膠囊組和開同組之間無明顯差異。提示營養(yǎng)膠囊可以X椉櫻茫耍哪Ｐ痛笫箅璩√寤�，讣{乒趨蘭∥踝刺�，＜邋０．０�(dān)煎澹埃埃埃薄ｅ義希櫻瑁幔礤危停錚洌澹戾危櫻櫻伲伲剩五危耍鈴義

本文編號：2821873