研究背景:宮頸癌(Cervical cancer,CC)是目前最常見的婦科惡性腫瘤之一,其已經(jīng)成為15至44歲女性癌癥死亡的第二大主要病因。流行病學(xué)研究表明,99.7%的宮頸癌患者均伴有高危型人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染。人乳頭瘤病毒是嗜上皮性DNA病毒,在眾多的HPV亞型中,約40種能感染生殖道粘膜,其中高危型HPV-16和18型感染導(dǎo)致了 70%以上的宮頸癌的發(fā)生,低危型HPV如HPV-6、11等則主要引起感染部位的低度病變、生殖器或皮膚疣和尖銳濕疣。高危型HPV病毒的持續(xù)性感染是導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生癌變的重要條件。通常,病毒感染會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分泌大量炎癥因子,從而導(dǎo)致慢性炎癥的發(fā)生。而慢性炎癥在在腫瘤形成過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,癌相關(guān)炎癥因子的高表達(dá)能促進(jìn)腫瘤的侵襲,從而促進(jìn)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和血管生成。隨著腫瘤的生長(zhǎng),其內(nèi)部供氧不充分,該缺氧環(huán)境導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生成更多新生血管,以補(bǔ)給供氧。同時(shí),癌相關(guān)炎癥因子通過(guò)激活多種信號(hào)通路,促進(jìn)腫瘤血管生成,加快腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。中藥單體丹酚酸B(Salvianolic acid B,SalB)是丹參主要的水溶性組分之一,在眾多丹參的酚酸提取物中含量最為豐富,且具有多種生物學(xué)活性,其被報(bào)道具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)凋亡、抑制血小板聚集、改善冠狀微循環(huán)等作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn),丹酚酸B能有效抑制三株HPV假病毒株感染靶細(xì)胞,本研究深入探討了丹酚酸B發(fā)揮抗HPV病毒的作用機(jī)制。另外,由于丹酚酸B本身具有較好的抗炎活性,本研究進(jìn)一步探討了丹酚酸B對(duì)HPV感染后細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和腫瘤細(xì)胞血管生成的影響。本文研究的丹酚酸B來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、水溶性高、毒副作用小,且具有高效抗HPV及抗炎活性,因此極有可能被開發(fā)成為一類新的安全高效的雙功能抗HPV殺微生物劑用于防治HPV感染,減少宮頸癌的發(fā)生。研究方法:1.體外假病毒體系評(píng)估丹酚酸B抗HPV病毒效果,Time-of-addition、流式細(xì)胞術(shù)、Temperature shift、表面等離子共振等方法檢測(cè)丹酚酸B發(fā)揮抗病毒作用的可能作用機(jī)制和靶點(diǎn);2.熒光定量PCR、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)丹酚酸B對(duì)HPV感染誘發(fā)的炎癥因子表達(dá)的影響;3.熒光定量PCR、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)、Western blotting法檢測(cè)丹酚酸B對(duì)氯化鈷誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞HIF-1α、VEGF蛋白及其調(diào)節(jié)通路的影響;4.MTT法檢測(cè)丹酚酸B對(duì)正常生殖道細(xì)胞和子宮頸癌細(xì)胞的毒性作用;通過(guò)病理切片、ELISA及免疫組化法檢測(cè)丹酚酸B凝膠對(duì)家兔陰道粘膜的刺激性。研究結(jié)果:1.丹酚酸B能劑量依賴性地抑制HPV病毒感染靶細(xì)胞,其主要抑制病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的早期階段,能與病毒的主要衣殼蛋白L1特異性結(jié)合,進(jìn)而抑制HPV病毒顆粒黏附于靶細(xì)胞表面;2.丹酚酸B能劑量依賴性地下調(diào)HPV感染HeLa細(xì)胞后炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8 mRNA的表達(dá),降低IL-6、IL-8蛋白的表達(dá);3.丹酚酸B能劑量依賴性地下調(diào)氯化鈷誘導(dǎo)的宮頸癌Siha細(xì)胞HIF-1α及下游VEGF蛋白的表達(dá),其通過(guò)影響PI3K/AKT和ERK1/2通路抑制HIF-1α蛋白的合成;4.丹酚酸B對(duì)正常生殖道細(xì)胞和子宮頸癌細(xì)胞基本無(wú)毒,其CC50均大于800μg/ml。家兔陰道刺激性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,丹酚酸B凝膠對(duì)家兔陰道上皮無(wú)損傷,對(duì)陰道粘膜炎癥因子的釋放無(wú)明顯影響,不會(huì)引起的陰道上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的異常增殖。研究結(jié)論:丹酚酸B能抑制HPV病毒感染靶細(xì)胞的早期階段,其直接靶向病毒L1蛋白,阻止病毒黏附入侵靶細(xì)胞,進(jìn)而發(fā)揮抗病毒作用。此外,丹酚酸B能夠有效抑制HPV感染所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)和腫瘤細(xì)胞血管生成。丹酚酸B對(duì)正常生殖道細(xì)胞和子宮頸癌細(xì)胞基本無(wú)毒,不會(huì)誘導(dǎo)家兔陰道粘膜炎癥反應(yīng),安全性較高,因此極有可能被開發(fā)成為一類安全高效的多功能抗HPV殺微生物劑用于防治HPV感染。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

邐１００逡逑Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ邋ａｃｉｄ邋Ｂ邋（＾ｇ／ｍｌ）逡逑圖１－１：丹酚酸Ｂ能顯著抑制ＨＰＶ病毒感染靶細(xì)胞（Ａ．ＨＰＶ－６；Ｂ．ＨＰＶ－１６；Ｃ．ＨＰＶ－１８）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１：邋Ｔｈｅ邋ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ邋ａｃｉｄ邋Ｂ邋ｏｎ邋ＨＰＶ邋ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋（Ａ．ＨＰＶ－６；邋Ｂ．ＨＰＶ－１６；逡逑Ｃ．ＨＰＶ－１８）逡逑２．丹裔酸Ｂ能作用在病栜入酬胞的早期階段逡逑通過(guò)Ｔｉｍｅ－ｏｆ－ａｄｄｉｔｉｏｎ實(shí)驗(yàn)，即在病毒入侵耙細(xì)胞的不同時(shí)間點(diǎn)（０、２、４、逡逑６、８、１０和１２邋ｈ）加入丹酚酸Ｂ，觀察其抗病毒活性的變化，分析藥物可能的逡逑作用環(huán)節(jié)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在病毒進(jìn)入靶細(xì)胞前加入丹酚酸Ｂ邋（５０卩ｇ／ｍｌ），其逡逑幾乎完全抑制ＨＰＶ病毒的復(fù)制，抑制率達(dá)８０？１００％邋（圖１－２）。但當(dāng)在病毒感逡逑染靶細(xì)胞后加入丹酚酸Ｂ時(shí)，其抗病毒活性逐漸下降，且隨著病毒感染時(shí)間的逡逑延長(zhǎng)，丹酚酸Ｂ抗病毒活性也進(jìn)一步下降。上述結(jié)果提示，丹酚酸Ｂ對(duì)病毒進(jìn)逡逑１５逡逑

３．丹酚酸Ｂ抑制ＨＰＶ病毒結(jié)合靶細(xì)胞逡逑病毒結(jié)合靶細(xì)胞是ＨＰＶ感染宿主細(xì)胞的第一步，前述結(jié)果提示丹酚酸Ｂ可逡逑能在病毒感染細(xì)胞的早期階段發(fā)揮作用，這種作用是否是由于藥物抑制了病毒逡逑與靶細(xì)胞之間的結(jié)合呢？由于ＨＰＶ邋Ｌ１基因編碼的ＨＰＶ邋Ｌ１蛋白是ＨＰＶ的主要逡逑衣殼蛋白，其是介導(dǎo)病毒入侵靶細(xì)胞的關(guān)鍵因子。這里，我們采用免疫熒光染逡逑色法對(duì)感染細(xì)胞表面的ＨＰＶ邋１６邋Ｌ１蛋白染色，觀察藥物對(duì)細(xì)胞表面Ｌ１蛋白表達(dá)逡逑的影響。將丹酚酸Ｂ與ＨＰＶ１６病毒混合液加入ＨｅＬａ細(xì)胞中孵育，２４ｈ后棄上逡逑清，對(duì)ＨＰＶ邋１６邋Ｌ１蛋白進(jìn)行熒光染色后觀察發(fā)現(xiàn)，ＨＰＶ病毒處理組中，細(xì)胞表逡逑面觀察到顯著的Ｌ１蛋白熒光表達(dá)（圖１－３邋Ｂ），邋１０邋ｐｇ／ｍｌ丹酚酸Ｂ處理組（圖１－３逡逑Ｃ）與１００ｐｇ／ｍｌ丹酚酸Ｂ處理組（圖１－３Ｄ）中細(xì)胞表面Ｌ１蛋白的熒光表達(dá)量逡逑顯著下降，且呈劑量依賴性。上述結(jié)果表明，丹酚酸Ｂ能有效抑制ＨＰＶ與靶細(xì)逡逑胞的結(jié)合。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑

１２、２５、５０及１００ｊｘｇ／ｍｌ）丹酚酸Ｂ的ＨＰＶ病毒顆粒，其黏附靶細(xì)胞的能力明逡逑顯下降，后期恢復(fù)生理?xiàng)l件時(shí)，病毒內(nèi)吞并感染靶細(xì)胞的能力顯著下降，且具逡逑有顯著的劑量依賴性（圖１－４）。上述結(jié)果表明，丹酚酸Ｂ能一定程度地抑制ＨＰＶ逡逑病毒黏附靶細(xì)胞，進(jìn)而抑制病毒內(nèi)吞入胞過(guò)程，其可能是丹酚酸Ｂ抗ＨＰＶ病毒逡逑的作用機(jī)制之一。逡逑２００００邋ｔ邐＾邋ＨＰＶ－１６逡逑＿邋１５０００－邋ｇ邐＊＊＊邐Ｅ３邋ＨＰＶ－１８逡逑皇邐W 邐ｉ邐＊：邐＊＊＊逡逑ｈ邋５０００N■柋哢？邐＊＊＊逡逑！邐３０００

本文編號(hào)：2820376