鉤藤(Uncariae Ramulus Cum Unicis)是一種常用的息風止痙類中藥,其主要活性成分為生物堿,臨床上用于治療心血管及中樞神經系統(tǒng)疾病。2015版《中國藥典》將五種茜草科植物,包括鉤藤Uncaria rhynchophylla(Miq.)Miq.ex Havil、大葉鉤藤U.macrophylla Wall.、毛鉤藤U.hirsuta Havil.、華鉤藤U.sinensis(Oliv.)Havil.和無柄果鉤藤U.sessilifructus Roxb.的干燥帶鉤莖枝一同列為中藥鉤藤的基原植物,但這五種鉤藤中生物堿成分的差異尚不明確,缺乏系統(tǒng)的化學表征和比較;氧化吲哚生物堿作為質控的重要指標成分,其制備分離困難;市售鉤藤的植物基原不明確,缺乏有效的判別手段,因此阻礙了對中藥鉤藤質量的有效控制。針對以上問題,本論文基于液相-高分辨質譜(LC-HRMS)分析平臺,提出“活性生物堿成分群”系統(tǒng)研究策略,建立靈敏、高效的靶向表征方法,對五種鉤藤的生物堿進行系統(tǒng)的表征和比較,以闡明多基原鉤藤的化學物質基礎,為其質量控制提供科學依據(jù)。1.五種鉤藤的生物堿成分研究構建鉤藤屬樣品庫,收集并鑒定五種鉤藤共150批;構建基于UNIFI軟件的鉤藤屬生物堿數(shù)據(jù)庫,收錄生物堿結構143個;采用UHPLC/LTQ-Orbitrap質譜,在正離子模式下對五種鉤藤進行化學輪廓分析,通過自建數(shù)據(jù)庫檢索和多級質譜信息比對等鎖定目標生物堿;開展LC-MS導向的大葉鉤藤、毛鉤藤、華鉤藤和鉤藤的化學成分研究,分離鑒定了38個生物堿,其中9個為新化合物。2.不穩(wěn)定對照品的制備方法研究以大葉鉤藤中四個氧化吲哚生物堿的分離為例,開發(fā)不穩(wěn)定生物堿對照品的分析制備方法。采用以CO_2作為流動相的超臨界流體色譜(SFC)技術,選擇能使化合物穩(wěn)定存在的乙腈作為流動相改性劑,進一步優(yōu)化固定相、流動相添加劑、柱溫、背壓和流速等,分別采用Torus 1-AA和Torus Diol柱,建立了兩個超高效SFC分析方法;并采用制備SFC和Viridis Prep Silica 2-EP OBD制備柱得到純度大于95%的四個化合物。3.五種鉤藤中生物堿的系統(tǒng)表征和比較通過系統(tǒng)研究對照品裂解規(guī)律及二維液相分離和質譜靶向表征方法,本論文提出多種新穎的LC-MS分析策略,并對五種鉤藤的生物堿進行了系統(tǒng)表征和比較。(1)采用UHPLC/LTQ-Orbitrap質譜,在正離子模式下研究了48個生物堿的MS~n裂解行為,總結了不同亞型生物堿的裂解規(guī)律。通過比較CID(collision-induced dissociation)和HCD(high-energy C-trap dissociation)模式下生物堿裂解行為的差異,建立了MS~2/CID-MS~3/HCD碎片獲取方法。(2)采用UHPLC/LTQ-Orbitrap質譜對生物堿靶向表征方法進行深入的研究,并建立了三個基于質量虧損過濾(MDF)的靶向表征方法。方法一:結合傳統(tǒng)的矩形MDF和中性丟失過濾(162.05 Da)方法,分別過濾游離生物堿和生物堿糖苷成分,最終從鉤藤(U.rhynchophylla)中鑒定了60個游離生物堿和32個生物堿糖苷;方法二:構建多邊MDF算法,靶向過濾潛在的生物堿,同時結合母離子列表(PIL)高選擇性地觸發(fā)多級質譜裂解,最終從華鉤藤莖、葉、花三個部位中共鑒定了198個生物堿;方法三:基于PIL的在線柵狀MDF方法,結合理論的步進式母離子列表(step-wise PIL)和最優(yōu)的母離子質量寬度(±55 mDa),在數(shù)據(jù)采集的同時實現(xiàn)柵狀MDF過濾,靶向靈敏地觸發(fā)目標生物堿的質譜裂解。(3)基于不同pH條件下帶正電荷反相和傳統(tǒng)反相的正交分離機制,分別采用酸性條件下的XCharge C18柱和堿性條件下的Kinetex EVO C18柱作為第一維和第二維色譜柱,構建了離線全二維液相分離系統(tǒng)。結合二維液相系統(tǒng)和基于step-wise PIL的柵狀MDF掃描方法,對五種鉤藤的生物堿進行系統(tǒng)表征。最終共鑒定了1227個生物堿,其中鉤藤657個,毛鉤藤361個,大葉鉤藤407個,華鉤藤410個,無柄果鉤藤248個。通過系統(tǒng)比較五種鉤藤的生物堿,獲取了單個品種的特征生物堿成分群和生物堿的亞型分布特點。4.五種鉤藤的區(qū)分和市售鉤藤的植物基原判別基于植物代謝組學方法對多批次多基原鉤藤的化學成分進行系統(tǒng)比較。通過無監(jiān)督的PCA模型可以看出,除毛鉤藤和華鉤藤,其他品種之間均能很好地區(qū)分,而且種內的差異明顯小于種間的差異。此外,以特征生物堿為變量建立支持向量機模型,實現(xiàn)了五種鉤藤的區(qū)分和鑒別,以及市售鉤藤的植物基原分析。結果表明,市售鉤藤的主要植物基原為鉤藤(U.rhynchophylla)。通過以上研究,本論文1)開發(fā)了不穩(wěn)定氧化吲哚生物堿的制備方法,為中藥對照品的制備分離提供了解決方案;2)提出了基于LC-HRMS的靶向生物堿表征策略,為中藥復雜體系中目標成分的選擇性表征提供了有益參考;3)建立了支持向量機模型,實現(xiàn)了五種鉤藤的鑒別和市售鉤藤的植物基原分析,為中藥的植物基原判別提供了有效手段;4)系統(tǒng)表征和比較了五種鉤藤的生物堿成分,闡明了五種鉤藤生物堿成分的差異,為進一步研究中藥鉤藤多基原共用是否合理奠定了基礎,為構建科學合理的中藥鉤藤質量標準提供了科學依據(jù)。
【學位單位】：中國科學院大學(中國科學院上海藥物研究所)
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R284;O657.63


本文編號：2816747