【摘要】：腦卒中是一種常見的疾病,絕大多數(shù)腦卒中病例是由短暫性或永久性腦血管閉塞引起的缺血性腦血管病(缺血性中風)最終導(dǎo)致腦梗死。缺血性中風是一種高度復(fù)雜和異質(zhì)性的疾病,缺血后興奮性毒性氨基酸的釋放,炎性因子、趨化因子的釋放等,都會對神經(jīng)元產(chǎn)生二次損傷。星形膠質(zhì)細胞做為腦內(nèi)大量存在的細胞,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的管家細胞,其在神經(jīng)興奮時清除多余的興奮性遞質(zhì)、控制離子和水分子動態(tài)平衡、釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子、轉(zhuǎn)移代謝產(chǎn)物和廢棄物、參與血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)形成、調(diào)控局部腦血流等方面有重要作用。因此,探討星形膠質(zhì)細胞在缺血性腦血管病中的作用,探索有效中藥對其的作用機制,對防治腦血管疾病具有一定的意義。目的:整體與細胞水平,探討缺血缺氧狀態(tài)下星形膠質(zhì)細胞過度增殖、神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞、炎性反應(yīng)及LCN2蛋白誘導(dǎo)的相關(guān)信號通路的相關(guān)性;在此基礎(chǔ)上,探討中藥復(fù)方SLT及其部分有效成分對星形膠質(zhì)細胞相關(guān)功能的干預(yù)作用與相關(guān)機制的研究。方法:第一部分——SLT治療急性期多發(fā)性腦梗死大鼠的作用機制研究——采用大鼠微球法至多發(fā)性腦梗死實驗?zāi)Ｐ?通過神經(jīng)行為評分、透射電鏡觀察星形膠質(zhì)細胞超微結(jié)構(gòu)、HE染色觀察病理學(xué)形態(tài)評價SLT對皮層區(qū)損傷的保護作用;根據(jù)組織內(nèi)及血清內(nèi)炎性因子的表達,以及qPCR、免疫熒光、免疫印跡觀察星形膠質(zhì)細胞的活化、特異蛋白LCN2及其誘導(dǎo)的JAK2\STAT3信號通路的變化,以考察腦缺血損傷后星形膠質(zhì)細胞的活化與炎性反應(yīng)的關(guān)系及SLT對缺血損傷皮層區(qū)星形膠質(zhì)細胞功能的影響。第二部分——SLT治療恢復(fù)期多發(fā)性腦梗死大鼠的作用機制研究——采用大鼠微球法至多發(fā)性腦梗死實驗?zāi)Ｐ?依據(jù)前期結(jié)果,首先通過microRNA基因組學(xué)評價恢復(fù)期腦梗死大鼠缺血側(cè)大腦組織內(nèi)microRNA的變化,根據(jù)前期急性期結(jié)果尋找相關(guān)的靶基因、相關(guān)通路以及SLT可能的作用靶點;其次通過Morris水迷宮實驗評價SLT對恢復(fù)期大鼠空間記憶功能障礙的影響;隨后,根據(jù)組織內(nèi)及血清內(nèi)炎性因子的表達,以及qPCR、免疫熒光、免疫印跡觀察星形膠質(zhì)細胞的活化、特異蛋白LCN2及其誘導(dǎo)的JAK2\STAT3信號通路的變化,以考察恢復(fù)期腦缺血損傷后星形膠質(zhì)細胞的活化與炎性反應(yīng)的關(guān)系及SLT對恢復(fù)期缺血損傷皮層區(qū)星形膠質(zhì)細胞功能的影響。第三部分——SLT及主要有效成分抗HA細胞缺氧復(fù)氧損傷機制研究——選擇SLT及主要活性成分銀杏葉總提物進行細胞水平的研究。首先建立人星形膠質(zhì)細胞——Human Astrocyte細胞培養(yǎng)體系,通過CCK8法考察二者對正常培養(yǎng)HA細胞活力的影響;隨后,依據(jù)前期基礎(chǔ)及參考文獻建立HA細胞糖氧誘導(dǎo)(oxygen-glucose deprivation,OGD)損傷模型,并采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法過表達目的基因LCN2,檢測細胞分泌炎性因子含量變化,免疫熒光、蛋白免疫印跡觀察星形膠質(zhì)細胞的活化、特異蛋白LCN2及其誘導(dǎo)的JAK2\STAT3信號通路的變化,考察星形膠質(zhì)細胞損傷后SLT有效成分對其的影響。結(jié)果:在第一部分實驗中,我們觀察到如下結(jié)果:與模型組相比,SLT可顯著降腦缺血大鼠神經(jīng)行為評分的分值,銀杏葉提取物亦能降低腦缺血大鼠神經(jīng)行為評分的分值,但較SLT組分值略高;SLT可有效減輕星形膠質(zhì)細胞的活化及增殖,SLT組缺血側(cè)病變減輕,皮層神經(jīng)元少量變性,核固縮和核溶解程度減輕,神經(jīng)元的凋亡與壞死受到抑制,較為明顯改善腦腦缺血損傷大鼠皮層缺血周邊半暗帶區(qū)神經(jīng)元及突觸超微結(jié)構(gòu)損傷;SLT可抑制缺血側(cè)皮層區(qū)及血清內(nèi)炎性因子及趨化因子的表達,根據(jù)免疫熒光與免疫印跡的結(jié)果看出,SLT可能通過抑制LCN2誘導(dǎo)的JAK2/STAT3信號通路的表達來抑制炎性反應(yīng)。在第二部分試驗中,首先我們發(fā)現(xiàn),對于腦缺血恢復(fù)期大鼠,SLT可減少部分缺血側(cè)組織的microRNA差異,并可預(yù)測到與LCN2-JAK2/STAT3通路有關(guān);其次,SLT及銀杏葉提取物可顯著降低腦缺血引起的大鼠空間記憶認知功能障礙,與急性期結(jié)果相似,SLT可有效減輕星形膠質(zhì)細胞的活化及增殖,SLT組缺血側(cè)病變減輕,皮層神經(jīng)元少量變性,核固縮和核溶解程度減輕,神經(jīng)元的凋亡與壞死受到抑制,較為明顯改善腦腦缺血損傷大鼠皮層缺血周邊半暗帶區(qū)神經(jīng)元及突觸超微結(jié)構(gòu)損傷;SLT可抑制缺血側(cè)皮層區(qū)及血清內(nèi)炎性因子及趨化因子的表達,根據(jù)免疫熒光與免疫印跡的結(jié)果看出,SLT可能通過抑制LCN2誘導(dǎo)的JAK2/STAT3信號通路的表達來抑制炎性反應(yīng)。第三部分實驗中,細胞水平結(jié)果與整體水平結(jié)果互相印證,SLT與EGB阻斷了 OGD誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞內(nèi)JAK2/STAT3的激活和炎性因子的生成,而LCN2的過度表達顯著增強了這些效應(yīng);SLT與EGB下調(diào)了 LCN2過表達增強的這些效應(yīng)。結(jié)論:(1)缺血缺氧損傷后,星形膠質(zhì)細胞過度活化增殖,從而誘導(dǎo)一系列的炎性反應(yīng),并激活LCN2誘導(dǎo)的JAK2/STAT3信號通路;(2)SLT及其有效成分可能以LCN2為靶點,抑制星形膠質(zhì)細胞的活化,從而抑制進一步的炎性反應(yīng),以達到治療缺血性腦血管病的目的。
【學(xué)位授予單位】：中國中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

鼠的腦缺血再灌注損傷，新生小鼠的缺氧缺血性損傷以及糖氧誘導(dǎo)條件下的神經(jīng)逡逑元和神經(jīng)膠質(zhì)共培養(yǎng)獲得的結(jié)果表明，ＬＣＮ２通過直接的神經(jīng)毒性作用參與缺血逡逑性腦損傷，并且加劇了神經(jīng)炎性反應(yīng)（圖１）。逡逑Ｗａｎｇ等人？通過ｔＭＣＡＯ和永久性大腦中動脈阻塞（ｐｅｒｍａｎｅｎｔ邋ｍｉｄｄｌｅ逡逑ｃｅｒｅｂｒａｌ邋ａｒｔｅｒｙ邋ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ，邋ｐＭＣＡＯ）模型證實，ＬＣＮ２對缺血腦中的神經(jīng)毒性和逡逑神經(jīng)炎癥促進作用。再灌注后，梗死區(qū)的星形膠質(zhì)細胞和嗜中性粒細胞分別檢測逡逑２０逡逑

邐ＳＬＴ對缺血性腦血管病星形膠質(zhì)細胞功能損傷的影響及保護機制的研究邐逡逑活ＩＫＫ／ＮＦ－ｋＢ通路，誘導(dǎo)ＮＯ生成，促進ＧＦＡＰ活化和ＣＸＣＬ１０的生成［１８，１９］。逡逑ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３通路和ＩＫＫ／ＮＦ４Ｂ通路為ＬＣＮ２促進ＣＮＳ發(fā)生炎性反應(yīng)的兩個主要通逡逑路。此外，ＬＣＮ２還可通過上調(diào)ＩＬ－６和下調(diào)ＰＩＡＳ３，使ＳＴＡＴ３活化，誘導(dǎo)ＧＦＡＰ活逡逑化和ＣＸＣＬ１０的生成［２Ｇ，２１］。逡逑

３結(jié)果逡逑３．邋１邋ＳＬＴ及ＥＧＢ對大鼠腦缺血術(shù)后２邋ｈ及２４邋ｈ神經(jīng)行為學(xué)評分的影響逡逑與模型組相比較，ＳＬＴ可顯著降低腦缺血大鼠神經(jīng)行為評分的分值，見圖１。逡逑｜４１邐＊＊＊邐Ｉ４］邐＊＊＊逡逑ｆ邋３－邐Ｔ邐ｍ邋Ｉ３－邐�。＃ｅ义希策姸。＃ｅ�0邐—邋＃＃逡逑８邐１邋－Ｔ－邋ｓ邐丁邋＿逡逑２－邐，邋丁邐Ｓ邋２－邐Ｔ逡逑Ｓ邐Ｉ＇邋－邋＇邋Ｓ邐；邋；邋１逡逑°邋１－邐■邐＿象１－逡逑■邋２逡逑ｃ邋0Ｊ邐．邐．邐—ｒ－邐１邐邋Ｉ邋０－Ｉ邐．邐．邐邋．邐逡逑？邋＾邐＾邐＾邐／邐凌命逡逑圖１邋ＳＬＴ對多發(fā)性腦梗死大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分的影響（ｘ邋土邋ｓ，邋ｎ邋＝邋１０）逡逑l:l:本ｐ邋＜邋０．００１邋ｖｓ．邋ｓｈａｍ邋ｇｒｏｕｐ；邋＃＃ｐ邋＜邋０．邋０１邋ｖｓ．邋ｔｈｅ邋ｍｏｄｅｌ邋ｇｒｏｕｐ逡逑３．邋２邋ＳＬＴ及銀杏葉提取物對腦缺血大鼠梗死面積的影響逡逑ＴＴＣ染色結(jié)果顯示，腦缺血后有顯著的腦梗死灶，與模型組相比，ＳＬＴ與ＥＧＢ逡逑均能減少梗死面積，且ＳＬＴ效果較為顯著，結(jié)果見圖２。逡逑Ｓｈａｍ邋Ｍｏｄｅｌ邋ＥＧＢ邐ＳＬＴ邐Ｓｈａｍ邋Ｍｏｄｅｌ邐ＥＧＢ邐ＳＬＴ逡逑：邋ｊＥＵＩ逡逑ｎｒｉＬ邋ｉｒｉ邋ｎｎｎｎ逡逑ｒｉｎｒｉＬｊ邋ｊｎｉｒｉｒｉｎ逡逑ｎｍｎ邋□□□□逡逑□□□□邋ｔｌ邋口逡逑圖２邋ＳＬＴ對多發(fā)性腦梗死大鼠腦梗死灶的影響逡逑４８逡逑

【參考文獻】

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1 張業(yè)昊;叢偉紅;徐立;楊斌;姚明江;宋文婷;劉建勛;;塞絡(luò)通膠囊對局灶型腦缺血/再灌注大鼠線粒體動力學(xué)的影響[J];中國中藥雜志;2015年10期

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本文編號：2802643