【摘要】：目的:生物堿是一類(lèi)含氮有機(jī)化合物,其包含許多天然產(chǎn)物(如喜樹(shù)堿、麻黃堿、烏頭堿、士的寧)和合成藥物(如普魯卡因、三氟拉嗪、阿米替林)。生物堿具有廣泛的藥理活性,如抗病毒、抗菌、抗癌、抗炎及抗抑郁活性。N-葡萄糖醛酸化代謝(NG代謝)是多種叔胺生物堿在人體內(nèi)重要的代謝途徑,可極大地影響叔胺生物堿在體內(nèi)的濃度,從而改變其藥效/毒性。然而,叔胺生物堿的NG代謝行為和規(guī)律尚不明確,其影響因素仍需闡明。本論文研究將評(píng)價(jià)葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGTs)在叔胺生物堿NG代謝中的作用,闡明外排轉(zhuǎn)運(yùn)體和核受體對(duì)NG代謝的調(diào)控效應(yīng)及作用機(jī)制。具體研究目標(biāo)如下:(1)建立NG代謝的體外評(píng)價(jià)體系,測(cè)定叔胺生物堿的NG代謝活性;(2)評(píng)價(jià)UGT1A4和UGT2B10在叔胺生物堿NG代謝中的作用,考察NG代謝的種屬間差異;(3)明晰外排轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)NG代謝產(chǎn)物的外排作用,考察其對(duì)NG代謝的調(diào)控效應(yīng);(4)明確調(diào)控NG代謝的關(guān)鍵核受體,闡明調(diào)控機(jī)制。方法:1. 采用UGT1A4和UGT2B10特異性底物(三氟拉嗪、可替寧和阿米替林)建立NG代謝的體外代謝體系�？疾炀彌_鹽種類(lèi)、p H值、打孔劑、Mg Cl_2濃度、UDPGA濃度和β-葡萄糖醛酸苷水解酶抑制劑對(duì)NG代謝的影響,優(yōu)化體外代謝條件。在優(yōu)化條件下測(cè)定叔胺生物堿的NG代謝活性,采用液相-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)生成的N-葡萄糖醛酸苷進(jìn)行鑒定。此外,采用UGT1A4和UGT2B10重組酶測(cè)定兩者對(duì)叔胺生物堿的代謝活性。2.對(duì)六種生物堿(米氮平、米安色林、苯甲嗪、氯苯甲嗪、士的寧和馬錢(qián)子堿)的NG代謝進(jìn)行全面表征,包括單酶篩選、動(dòng)力學(xué)測(cè)定、活性相關(guān)性分析、代謝抑制實(shí)驗(yàn)和種屬代謝差異分析。明晰UGT1A4和UGT2B10對(duì)生物堿NG代謝的貢獻(xiàn)程度。3.采用慢病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建UGT2B10高表達(dá)HEK293細(xì)胞(簡(jiǎn)稱(chēng)為HEK2B10細(xì)胞)。通過(guò)q PCR法、蛋白免疫印跡分析和活性檢測(cè)對(duì)該細(xì)胞模型的UGT2B10表達(dá)及活性進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定三種生物堿(阿米替林、米安色林和苯甲嗪)在HEK2B10細(xì)胞中的代謝和代謝物外排。通過(guò)化學(xué)抑制法(MK571和Ko143)和生物抑制法(sh RNA),明確外排轉(zhuǎn)運(yùn)體(BCRP和MRP4)對(duì)NG代謝的調(diào)控效應(yīng)。4.采用q PCR法測(cè)定代謝酶調(diào)控核受體在Hep G2細(xì)胞中的表達(dá)�？疾旌耸荏w激動(dòng)劑對(duì)細(xì)胞中UGT2B10表達(dá)和活性的影響,明確調(diào)控UGT2B10的關(guān)鍵核受體。結(jié)合啟動(dòng)子報(bào)告基因分析、凝膠遷移分析和染色質(zhì)免疫共沉淀分析等分子生物學(xué)技術(shù)闡明關(guān)鍵核受體對(duì)UGT2B10的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果:1. 建立了NG代謝體外評(píng)價(jià)體系根據(jù)特異性底物最大代謝速率原則,我們建立了NG代謝體外評(píng)價(jià)體系。該體系含:100 m M Tris-HCl緩沖液(p H 7.4),4 m M Mg Cl_2,20μg/m L alamethicin,及8 m M UDPGA。采用該反應(yīng)體系,我們準(zhǔn)確測(cè)定了三氟拉嗪(UGT1A4特異性底物)、可替寧(UGT2B10特異性底物)和阿米替林在個(gè)體肝微粒體中的代謝活性。阿米替林(5和100μM)的代謝速率與可替寧(2 m M)的代謝速率顯著相關(guān)(r0.8,p0.001),而與三氟拉嗪(40μM)的代謝速率相關(guān)性差。該結(jié)果說(shuō)明低濃度的阿米替林可作為UGT2B10特異性底物,用于肝微粒體UGT2B10活性的表征。2.UGT1A4和UGT2B10催化多種生物堿的NG代謝我們發(fā)現(xiàn)了17種可發(fā)生NG代謝的生物堿,包括阿塞那平、洛沙平、氯氮平、氯丙嗪、度硫平、多塞平、米氮平、米安色林、氯苯甲嗪、苯甲嗪、異丙嗪、環(huán)苯扎林、伊馬替尼、倒千里光堿、士的寧、曲唑酮和馬錢(qián)子堿。重組酶代謝結(jié)果表明,曲唑酮不被UGT1A4和UGT2B10代謝,倒千里光堿和馬錢(qián)子堿只被UGT1A4代謝,其余生物堿均可被UGT1A4和UGT2B10代謝。3.UGT2B10為催化叔胺生物堿NG代謝的主要代謝酶UGT2B10主要代謝五種生物堿(米氮平、米安色林、苯甲嗪、氯苯甲嗪和士的寧),其不代謝馬錢(qián)子堿。與UGT1A4相比,UGT2B10介導(dǎo)的生物堿NG代謝具有更低的K_m值,說(shuō)明UGT2B10與生物堿分子間有更強(qiáng)的結(jié)合力。提示UGT2B10可能在體內(nèi)NG代謝中發(fā)揮更為重要的作用。4.叔胺生物堿的NG代謝存在顯著的種屬間差異生物堿(三氟拉嗪、可替寧、阿米替林、米氮平、米安色林、苯甲嗪、氯苯甲嗪、士的寧和馬錢(qián)子堿)在人和動(dòng)物(猴子、小鼠、大鼠、兔子、狗和豚鼠)肝臟中的NG代謝存在顯著差異。這些生物堿在大鼠和小鼠中幾乎不發(fā)生NG代謝。該結(jié)果說(shuō)明常規(guī)動(dòng)物不適合作為人體NG代謝研究模型。5.外排轉(zhuǎn)運(yùn)體(BCRP和MRP4)可調(diào)控NG代謝我們成功構(gòu)建了UGT2B10高表達(dá)HEK293細(xì)胞(HEK2B10細(xì)胞)。三種生物堿(阿米替林、米安色林和苯甲嗪)在該細(xì)胞模型中均可被代謝生成相應(yīng)的N-葡萄糖醛酸苷(代謝物)。抑制外排轉(zhuǎn)運(yùn)體(BCRP和MRP4)功能或降低其表達(dá)可顯著降低代謝物的外排,增加代謝物在細(xì)胞內(nèi)的蓄積,表明BCRP和MRP4介導(dǎo)N-葡萄糖醛酸苷的外排轉(zhuǎn)運(yùn)。BCRP和MRP4抑制導(dǎo)致N-葡萄糖醛酸苷的總生成率減少,N-葡萄糖苷的總生成率增加。表明UGT2B10介導(dǎo)的NG代謝具有外排轉(zhuǎn)運(yùn)體依賴(lài)性(即所謂的“外排轉(zhuǎn)運(yùn)體-UGT代謝酶相互作用”)。同時(shí),N-葡萄糖化代謝可作為NG代謝的補(bǔ)償途徑。6.膽酸核受體FXR調(diào)控UGT2B10表達(dá)在Hep G2細(xì)胞中,FXR激動(dòng)劑(CDCA和GW4064)誘導(dǎo)UGT2B10的m RNA表達(dá),并增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)阿米替林(UGT2B10特異性底物)的代謝活性。啟動(dòng)子報(bào)告基因、EMSA和CHIP結(jié)果表明FXR通過(guò)與UGT2B10近端啟動(dòng)子上的IR1結(jié)合位點(diǎn)(-209~-197 bp)結(jié)合并激活UGT2B10的轉(zhuǎn)錄活性。同時(shí),所發(fā)現(xiàn)的IR1位點(diǎn)是控制UGT2B10啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵元件。因此,FXR是調(diào)控UGT2B10表達(dá)的關(guān)鍵核受體,其可能是影響UGT2B10在個(gè)體間表達(dá)差異的一個(gè)因素。結(jié)論:1. 本研究發(fā)現(xiàn)NG代謝是多種叔胺生物堿存在的代謝途徑,加深了對(duì)生物堿代謝通路的認(rèn)識(shí)與理解。2.本研究發(fā)現(xiàn)NG代謝具有顯著的種屬間差異,將有力指導(dǎo)模式動(dòng)物的合理選擇。3.本研究發(fā)現(xiàn)UGT1A4和UGT2B10是催化叔胺生物堿NG代謝的主要代謝酶,且UGT2B10在人體NG代謝中可能扮演著更為重要的角色,為UGT2B10的功能研究提供科學(xué)依據(jù)。4.本研究發(fā)現(xiàn)外排轉(zhuǎn)運(yùn)體(BCRP和MRP4)和核受體(FXR)均可調(diào)控NG代謝,揭示了體內(nèi)NG代謝的復(fù)雜性。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R285
【圖文】：

圖 1-1. （A）代謝酶在 1171 個(gè)底物代謝中的貢獻(xiàn)[12]。（B）2006~2015 年間 FDA 批準(zhǔn)的 125 個(gè)小分子藥物的代謝途徑[13]。Figure 1-1. (A) Involvement of drug metabolizing enzymes in the metabolism of 1171 substrates[12]. (B)Contribution of metabolizing pathways in the biotransformation of 125 small molecular drugs approvedby FDA during the period between 2006 and 2015[13].肝臟和胃腸道是發(fā)生藥物代謝的主要組織。對(duì)于口服藥物來(lái)說(shuō)，其進(jìn)入體循環(huán)前會(huì)先在胃腸道粘膜上皮細(xì)胞吸收階段被代謝，當(dāng)其通過(guò)門(mén)靜脈進(jìn)入肝臟后又會(huì)被代謝，該過(guò)程即為 首過(guò)代謝 。首過(guò)代謝是決定藥物口服生物利用度的關(guān)鍵因素。而對(duì)于靜脈注射的藥物而言，肝臟則是藥物發(fā)生代謝的主要場(chǎng)所。代謝改變藥物的血藥濃度及暴漏量，從而影響藥物在體內(nèi)的藥效和毒性。2 UGT 酶與葡萄糖醛酸化代謝2.1 UGT 代謝酶的功能

暨南大學(xué)博士學(xué)位論文結(jié)構(gòu)，并闡明了 UGT2B7 與輔酶（UDP-糖基）結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基[35]。迄今為止，一共發(fā)現(xiàn)了 22 個(gè)編碼人類(lèi) UGT 酶的基因[18; 34]。根據(jù)序列相似度可將人 UGT 劃分為四個(gè)家族：位于染色體 2q37 上的 UGT1，位于染色體 4q13 上的 UGT2，位于染色體 5p13.2 上的UGT3，以及位于染色體 4q26 上的 UGT8（圖 1-3）[16; 34]。

8圖 1-5. UGT1 和 UGT2 代謝酶在肝臟、腎臟和小腸中的 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平。數(shù)據(jù)來(lái)自文獻(xiàn)[43-45; 49]。Figure 1-5. mRNA expression levels of UGT1 and UGT2 enzymes in liver, kidney and intestine. Datawere collected from references[43-45; 49].研究表明， UGT1A5、1A6、1A7、1A9 和 2B7 在腎臟中有明顯表達(dá)[43; 45; 49]。UGT1A9、2B7 和 1A6 的表達(dá)量最為豐富，分別占腎臟中 UGT 總量的 47.19%、30.91%和 10.72%，且三者的總含量占 UGT 總量的~90%（圖 1-5）。此外，UGT1A1、1A3、1A4、1A8、1A10、2A3、2B4、2B11 和 2B17 的 mRNA 在部分腎臟樣品中可被檢測(cè)到，而其它 UGT 酶（UGT2A1、2A2、2B10、2B15 和 2B28）在腎臟中不表達(dá)。在腎臟中，UGT 酶促進(jìn)藥物或外源物從體內(nèi)的清除，其也調(diào)控腎臟的穩(wěn)態(tài)平衡。胃腸道也是發(fā)生 UGT 代謝的重要場(chǎng)所。UGT 酶在胃、小腸和結(jié)腸均有分布。研究表明，大多數(shù) UGT 酶在小腸中有表達(dá)，但各 UGT 酶的表達(dá)量存在顯著差異（附錄表 S1）[43;45]。UGT2B17、2B7、1A10、2A3、1A1、1A6。2B15 和 1A9 是小腸中表達(dá)最為豐富的 UGT代謝酶，分別占小腸 UGT 總量的 18.67%、18.4%、14.69%、11.86%、10.52%、6.74%、5.16%

本文編號(hào)：2802230