發(fā)布時(shí)間：2020-08-21 23:06

【摘要】：目的1.建立穩(wěn)定的高膽紅素HepaRG細(xì)胞模型;2.通過高膽紅素HepaRG細(xì)胞模驗(yàn)證茵梔黃“退黃”藥效并探究其機(jī)制;3.從茵梔黃已報(bào)道的化學(xué)成分中初步篩選茵梔黃“退黃”的潛在藥效物質(zhì)。方法1.通過膽紅素及丙磺舒共同干預(yù)HepaRG細(xì)胞建立高膽紅素細(xì)胞模型,以細(xì)胞內(nèi)總膽紅素(TBIL)和間接膽紅素(IBIL)含量評(píng)價(jià)細(xì)胞模型;2.采用茵梔黃提取物干預(yù)高膽紅素細(xì)胞,以細(xì)胞內(nèi)總膽紅素和間接膽紅素及細(xì)胞外直接膽紅素(DBIL)含量為指標(biāo)評(píng)價(jià)茵梔黃“退黃”作用;采用RT-q PCR和Western-blot技術(shù)考察茵梔黃干預(yù)后細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)體、代謝酶及核受體表達(dá)變化,探究茵梔黃“退黃”的分子機(jī)制。3.采用茵梔黃干預(yù)鹽酸苯肼誘導(dǎo)的高膽紅素大鼠,制備茵梔黃含藥血清,并用含藥血清干預(yù)高膽紅素HepaRG細(xì)胞;采用HPLC-MS/MS對(duì)茵梔黃提取物、含藥血清及細(xì)胞攝取物進(jìn)行分析,篩選出茵梔黃“退黃”的潛在藥效物質(zhì)。結(jié)果1.高膽紅素細(xì)胞模型的建立:高膽紅素模型以40μg/mL膽紅素和50μg/mL丙磺舒共同干預(yù)HepaRG細(xì)胞12 h后,細(xì)胞內(nèi)總膽紅素及間接膽紅素含量最高,且更換含50μg/mL丙磺舒的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)可使細(xì)胞內(nèi)高膽紅素狀態(tài)維持在48h內(nèi)穩(wěn)定。2.茵梔黃退黃作用及其分子機(jī)制研究:720μg/mL茵梔黃提取物(茵陳:18%,梔子:10%,黃芩:60%,金銀花:12%)干預(yù)高膽紅素HepaRG細(xì)胞24 h后,茵梔黃組細(xì)胞內(nèi)總膽紅素和間接膽紅素含量與模型組相比顯著下降(P0.01),且細(xì)胞外直接膽紅素含量顯著升高(P0.01),其作用與陽(yáng)性對(duì)照藥苯巴比妥相似(P0.05);而RT-q PCR和western-blot結(jié)果顯示,與模型組相比,茵梔黃組細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)體多藥耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(MRP2)、代謝酶UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1)及核受體組成型雄烷受體(CAR)的m RNA和蛋白表達(dá)均顯著升高(P0.05)。3.茵梔黃退黃藥效物質(zhì)的初步篩選:茵梔黃干預(yù)高膽紅素大鼠7 d后,其血清總膽紅素、直接膽紅素及間接膽紅素含量與模型對(duì)照組相比均顯著降低(P0.05),且大鼠含藥血清中測(cè)得茵梔黃已報(bào)道31種化合物中的10種;而含藥血清干預(yù)高膽紅素細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)測(cè)得源于茵梔黃的化合物7種,分別是漢黃芩素、D-焦谷氨酸、異嗪皮啶(6,8-Dimethoxy-7-hydroxycoumarin)、京尼平龍膽雙糖苷、Safflor yellow A及2種結(jié)構(gòu)未確定化合物。結(jié)論1.本研究通過膽紅素及丙磺舒干預(yù)HepaRG細(xì)胞,建立了穩(wěn)定的高膽紅素細(xì)胞模型;2.茵梔黃提取物可降低高膽紅素HepaRG細(xì)胞內(nèi)TBIL及IBIL含量,具有顯著的退黃作用,其藥效與陽(yáng)性對(duì)照藥苯巴比妥無差異;而其退黃作用可能與茵梔黃上調(diào)核受體CAR的表達(dá)而使膽紅素代謝酶UGT1A1及外排轉(zhuǎn)運(yùn)體MRP2的m RNA及蛋白表達(dá)增加有關(guān)。3.本研究通過細(xì)胞攝取含藥血清獲得的7種化合物,這7種化合物可能為茵梔黃退黃的潛在藥效物質(zhì)。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

大學(xué)碩士學(xué)位論文 茵梔黃方“退黃”分子機(jī)制及藥效物質(zhì)篩選初探、外界因素如毒素、化學(xué)物質(zhì)等，都會(huì)引起黃疸。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了人們對(duì)黃疸分子機(jī)制的研究，從分子上探究膽紅素在體內(nèi)的代謝、調(diào)節(jié)等過程，進(jìn)一步明確了黃疸發(fā)病的分子機(jī)紅素的代謝膽紅素是臨床診斷黃疸的重要指標(biāo)，其代謝的場(chǎng)所主要在肝臟[1]，主要包括胞對(duì)血液中非結(jié)合膽紅素（又稱間接膽紅素，unconjugated bilirubin，UCB）取、非結(jié)合膽紅素在肝細(xì)胞中的運(yùn)輸、非結(jié)合膽紅素向結(jié)合膽紅素（又稱直紅素，conjugated bilirubin，CB）的轉(zhuǎn)化以及結(jié)合膽紅素通過膽汁的外排 互關(guān)聯(lián)的生理過程[10, 11]（見圖 1-1）。在這些過程中，有多種酶、轉(zhuǎn)運(yùn)體及調(diào)子參與，而參與膽紅素生物轉(zhuǎn)化的這些因子出現(xiàn)表達(dá)或功能障礙，可能會(huì)導(dǎo)紅素代謝的異常，引起黃疸等相關(guān)疾�。ㄒ姳� 1-1）。

學(xué)位論文 茵梔黃方“退黃”分子機(jī)制及藥效果細(xì)胞毒性考察TT 比色法考察膽紅素對(duì) HepaRG 細(xì)胞的毒性，初步選定的膽紅素干預(yù)濃度。為了排除膽紅素溶劑 DMSO 對(duì)結(jié)果 DMSO 的培養(yǎng)基（DMSO : 培養(yǎng)基 = 1 : 20）干預(yù)細(xì)胞，性，不會(huì)影響膽紅素的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。、25、50、100、200、400 μg/mL 膽紅素干預(yù) HepaRG 細(xì)結(jié)果顯示，膽紅素在干預(yù) 24 h 時(shí)，25、50 及 100 μg/mL ，而 200 及 400 μg/mL 則有抑制作用。但干預(yù) 48 h 后，除 2度的細(xì)胞死亡率明顯升高，在 100 μg/mL 時(shí)細(xì)胞死亡率約胞死亡率約為 40%（圖 2-1）。因此，本文欲在 0-100 μg/mepaRG 細(xì)胞 24 h 篩選高膽紅素細(xì)胞造模劑量。

膽紅素干預(yù)HepaRG細(xì)胞24 h篩選高膽紅素細(xì)胞造模劑量，通過測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TBIL和 IBIL 濃度對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果如圖2-2所示，細(xì)胞內(nèi)的TBIL濃度隨膽紅素的干預(yù)濃度的增加而增加，而當(dāng)膽紅素干預(yù)濃度達(dá)到 40 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞內(nèi) TBIL 濃度不再隨膽紅素干預(yù)濃度發(fā)生變化， IBIL 變化與 TBIL 相似，說明膽紅素干預(yù)濃度為 40 μg/mL 時(shí)，細(xì)

【參考文獻(xiàn)】

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1 黃艷芳;黎春杏;周志鵬;商淵婷;黃鎖義;;茉莉花莖化學(xué)成分的預(yù)試驗(yàn)[J];時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥;2014年07期

2 張國(guó)強(qiáng);周燕;魏玉輝;朱琳;武新安;;茵梔黃顆粒對(duì)膽管結(jié)扎大鼠肝細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)體Mrp2、Ntcp及Bsep表達(dá)的影響[J];中成藥;2012年09期

3 茵梔黃口服液臨床研究協(xié)作組;馬曉路;施麗萍;陳理華;陳湘湘;杜立中;余加林;華子瑜;鐘丹妮;劉蕓芝;劉義;韋露明;黃韋芳;王俊平;陳運(yùn)彬;楊杰;白文靜;潘新年;韋秋芬;崔其亮;吳惠晴;陳麗萍;譚小華;李于凡;李貴南;嚴(yán)超英;劉英;劉鳳敏;劉海櫻;闞清;封云;程銳;周曉玉;韓樹萍;余章斌;董小s

本文編號(hào)：2799959